肝癌患者CD8+T,淋巴细胞对NY-ESO-1和MAGE-A3抗原钛的免疫应答
北京大学人民医院肝病研究所(100044)
陈红松 张华刚 彭吉润 商晓英 梅铭惠 冷希圣 魏来 陈慰峰

　　迄今为止，人们已经发现大量的癌/睾丸抗原（Cancer/testis antigen，CT抗原），包括MAGE、BAGE、GAGE、LAGE及NY-ESO-1等一系列抗原家族。它们仅在癌组织和睾丸、胎盘中表达，而正常组织一般认为不表达或个别组织有极低的表达。近年来，MAGE和NY-ESO-1成为研究的热点，一些体外及动物实验表明MAGE-1、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10、MAGE-12和NY-ESO-1是清除黑色素癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞理想的靶抗原。在很多国家正在进行基于MAGE和NY-ESO-1的肿瘤免疫治疗的I、II期临床试验。
　　在我国原发性肝细胞癌（HCC）属高发性肿瘤，死亡率很高。CT抗原能否作为潜在的治疗HCC的疫苗应用于临床，对于我国来说是具有重要意义的研究课题。本研究中，我们利用体外分离培养的HCC患者的DC递呈NY-ESO-1 p157-165或MAGE-A3 p271-279抗原肽，在体外诱导有效的针对这些抗原肽特异性的CTL应答。

材料和方法

　　1. 研究对象：49例原发性肝细胞癌（HCC）患者为北京大学附属临床医院和广西桂林医学院附属医院手术患者。癌组织标本在术中取材，术后均经病理诊断确证。采用美国PEL-FREEZA-SSP UNITRAY试剂盒对肝癌组织DNA进行PCR扩增，PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，根据电泳结果对细胞株HLA-A位点分型。
　　2.总RNA的提取和cDNA的合成：利用 Trizol试剂(Gibco BRL公司)提取肝癌组织总 RNA，溶于适量焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的超纯水中并定量。取5μg RNA标本，加入50ng随机引物和500ng Oligo-dT12-18后，加DEPC处理的超纯水至总体积为12μl。在70℃变性10min 后，冰浴2min。加入反应混合液8μl，其中包括2μl浓度为0?1mol/L的二硫苏糖醇、1μl的浓度为10mmol/L的dNTP、20U 的RNA酶抑制剂、200U逆转录酶SuperscriptⅡ和4μl的5×逆转录反应缓冲液，混匀后于42℃水浴1h，于70℃灭活15min。
　　3.抗原基因cDNA的PCR扩增：总反应体积为50μl。其中含2μl cDNA、25pmol CT基因的引物（MAGE-A3上游引物5’-TGGAGGACCAGAGGCCCCC-3’；下游引物5’-GACTTTCACATAGCTGGTTTC-3’；NY-ESO-1上游引物5’-ATGGATGCTGCAGATGCGG-3’；下游引物5’-GGCTTAGCGCCTCTGCCCTG-3’）、PCR缓冲液（20mM Tris-HCl，pH8?0；50mM KCl；1?5mM MgCl2）、0.2mM dNTP（Promega公司）和2?5U Taq酶，94℃预变性2min，反应循环条件为MAGE-A3：94℃30s，64℃45s，72℃45s，NY-ESO-1：94℃45s；60℃45s；72℃45s，35个循环后，72℃延伸7min。产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，MAGE-A3：967bp，NY-ESO-1：329bp。
　　4.PCR产物的纯化、克隆和测序：参照《分子克隆》（第3版）的方法。克隆使用pGEM-T克隆试剂盒（Promega公司）。由上海生工公司进行双向测序。
　　5.DC的体外分离和培养：患者外周静脉血经淋巴细胞分层液Ficoll（天津血液病研究所）梯度离心后分离界面单个核细胞。细胞经洗涤2 次后，用无血清培养基 AIM－V培养液（Gibco BRL公司）悬浮，调整细胞浓度到3×106个/ml，接种入6孔培养板。在37℃、5％CO2 孵箱中培养过夜后，轻轻吹打悬浮细胞并回收冻存，用以制备效应细胞。在贴壁细胞培养液中加入含1000U/ml 粒单集落刺激因子（先灵葆雅公司）和500U/ml 白细胞介素（IL-4，北京大学医学部免疫系提供）的AIM-V。培养至第7天时，收获悬浮的DC。
　　6.多肽合成：HLA-A2限制性多肽由北京赛百盛公司合成。序列为MAGE-A3 p271-279：FLWGPRALV。NY-ESO-1 p157-165：SLLMWITQC。用DMSO（Sigma公司）溶解至2g/L备用。T2 细胞与终浓度为20mg/L多肽共孵育4 h，洗涤后作为靶细胞。
　　7.多肽抗原递呈给CD8＋T细胞：HCC患者PBMC中分离纯化CD8＋T细胞，纯度＞95%。以5×105/孔种于48孔培养板。去除CD8＋T淋巴细胞的PBMC或DC加入2.5μg/ml　β2微球蛋白和10μg/ml多肽于37℃、5％CO2培养2h，经3000 rad 　γ射线照射后，以2：1或1：5加入培养板，并加入10 g/L IL-7（R&D公司）共孵育2天，然后加入10U/ml IL-2（R&D公司）和500U/ml IL-6（北京大学免疫学系生产）。7天后，再按照相同比例加入除CD8＋T淋巴细胞的PBMC或DC，7天后，再次重复刺激1次，作为效应T细胞。
　　8.IFN-γ Elispot分析：采用商业试剂盒（瑞典Mabtech公司）。培养板（美国Millipore公司）经IFN-γ单克隆抗体包被过夜，经封闭后，加入经多肽孵育过的T2细胞（5×104/孔）和效应T细胞（2.5×104/孔）。37℃孵育20h后，去除细胞，加入抗IFN-γ的生物素标记二抗，进而显色。斑点采用Champ Spot II Elispot系统读取（中国Sage Creation公司）。
　　9. 细胞内IFN-γ染色（CytoSpot）：采用细胞内细胞因子试剂盒（美国BD公司）进行染色分析。效应细胞中加入多肽刺激并射线照射过的DC（1×105/孔），1h后加Golgistop (0.7μl/ml)，继续培养5h，收集细胞，按常规方法染色CD8，加入破膜剂（cytoperm）于4℃反应20min后，洗细胞两次，再加入荧光标记抗IFN-γ抗体进行染色，然后用流式细胞仪检测。
　　10. 四聚体染色实验：效应T细胞中加入200U IL-2培养5天。用PE标记的NY-ESO-1 p157-165/HLA-A*0201或MAGE-A3 p271-279/HLA-A*0201四聚体染色15min。流式细胞仪读取数据。

结果

　　1.NY-ESO-1和MAGE-A3 mRNA的表达和序列分析结果：
　　检测NY-ESO-1 mRNA的42例HLA-A2＋HCC患者中28例癌组织为阳性，检测MAGE-A3 mRNA的41例HLA-A2＋HCC患者中26例癌组织为阳性，序列分析表明癌组织表达的NY-ESO-1和MAGE-A3基因序列之间与国外报道的序列（Genbank U87459和BC017389.1）之间均为100％同源，NY-ESO-1和MAGE-A3中包括HLA-A2限制性在内的多个CTL表位的氨基酸序列均无突变。
　　2.HLA-A2＋HCC患者中A2亚型分布：
　　38例经过分型的HCC患者中，A*0201占23.7%；A*0203占31.6%；A*0206占23.7%；A*0207占31.6%。
　　3.针对NY-ESO-1 和MAGE-A3多肽应答的CD8＋T细胞频率和强度（表1）：
　　经多肽直接或用CD8-T淋巴细胞或DC递呈，体外活化外周血T淋巴细胞，10例NY-ESO-1阳性HCC患者（10/28，35.7％）以及8例MAGE-A3患者（8/26，30.8％）产生针对多肽特异性的CD8＋T细胞免疫应答。IFN-γ释放Elispot分析显示，针对NY-ESO-1和MAGE-A3产生免疫应答的CD8＋T细胞数分别平均为0.3％［(89±59)/2.5×104个CD8＋T细胞］和0.71%［(356±253)/5×104个CD8+T细胞］。IFN-γ细胞内细胞因子染色的结果显示针对NY-ESO-1和MAGE-A3产生免疫应答的CD8＋T细胞数分别平均为CD8＋T细胞总数的1.2％和2.1％。四聚体法检测结果显示针对NY-ESO-1和MAGE-A3产生免疫应答的CD8＋T细胞数分别平均为CD8＋T细胞总数的0.91％和0.38％。HLA-A*0201、-A*0203、-A*0206、-A*0207亚型HCC患者均可产生针对NY-ESO-1 p157-165或MAGE-A3 p271-279抗原肽的免疫应答。
　　4.HCC分期与免疫应答的关系：
　　通过比较看出，相对II期10％～20％的应答率来说， III期和IV期患者产生应答的频率明显增高。

讨论

　　我国肝癌患者以HLA-A2为主，阳性率为53.5%，因此我们应首先研究基于HLA-A2的免疫治疗策略。NY-ESO-1和MAGE-A3在HCC患者的癌组织中表达率分别为40.0%和70.0%，NY-ESO-1和MAGE-A3中含有HLA-A*0201限制性多肽表位，因此理论上基于NY-ESO-1和MAGE-A3的免疫治疗具有广阔的应用前景。
　　在我国HCC患者中表达的NY-ESO-1和MAGE-A3抗原可能存在变异，从而影响用于免疫治疗的多肽疫苗的设计。我们将几乎全部NY-ESO-1和MAGE-A3的开放读码框序列扩增出来，通过测序推测出MAGE-A3中包含的HLA限制性多肽表位均没有发生变异。这为应用HLA-A2限制性CTL表位诱导CD8＋T细胞应答奠定了分子基础。
　　本研究采用3种不同的检测方法对产生免疫应答的CD8＋T细胞进行检测。26份标本的免疫应答检测（NY-ESO-1或MAGE-A3）采用了2～3种方法。其中仅有1例（ID38）的结果不吻合，Elispot为阴性，而四聚体检测结果为阳性。由于尽管存在TCR的表达，但没有功能性的细胞因子分泌，因此这一例结果认为是免疫应答阴性。本研究结果表明NY-ESO-1和MAGE-A3抗原肽可以有效地扩增HCC患者体内存在的针对肿瘤抗原的特异性CD8＋T细胞，HLA?A2＋并且CT抗原阳性的HCC患者中有35.7％和30.8％的比例人群可产生针对NY-ESO-1和MAGE-A3抗原肽的免疫应答，提示这些抗原肽可以作为潜在的HCC治疗性疫苗。同时，HCC患者存在的HLA-A*0201、-A*0203、-A*0206、-A*0207等检测出来的亚型均可产生针对NY-ESO-1 p157-165或MAGE-A3 p271-279抗原肽的免疫应答，这为扩大HLA-A*0201限制性多肽疫苗的适用人群的范围提供了实验依据。