摘　要:目的对胸腺肽α1 的固相合成工艺进行研究,并对合成产物进行活性评价。方法采用对碱敏感的Nα2芴甲氧羰基(Fmoc) 作为α2氨基的保护基,以Fmoc2Asn(Trt)2Wang Resin 为起点,逐个延伸固相合成法合成胸腺肽α1 。与Nα2Fmoc2基团配套的保护策略还有:叔丁氧羰基(Boc) 保护Lys 的侧链氨基,叔丁酯基(OtBu) 保护Asp 、Glu 的侧链羧基,叔丁氧基( tBu) 保护Ser、Thr 的侧链羟基,三苯甲基(Trt) 保护Asn 的侧链酰胺基。。采用DCC2HOBt 缩合剂法进行接肽反应,茚三酮定性显色法和水杨醛定量自由氨基检测法控制反应进程,肽段最后用TFA2DCM( V∶V = 1∶1) 定量地从树脂上切除。结果胸腺肽α1 总产率为3312 %。 纯化后的产物,经SDS2PAGE 和RP2HPLC 鉴定,纯度为98.8 %以上,活性与日达仙对照品相当。结论Nα2芴甲氧羰基保护策略的固相合成方法操作简便、条件温和、副反应少,产品纯度高、收率高。

 

    关键词:药物化学;制备;固相多肽合成;胸腺肽α1 ;Nα2芴甲氧羰基(Fmoc)

 

    中图分类号:R914 ;R965 　　　文献标识码:A

 

    胸腺肽α1 (Tα1) 是一种新型免疫调节因子,它通过诱导干细胞转化为成熟T 淋巴细胞,刺激淋巴系统,提高机体免疫功能[1 ] ,临床上应用Tα1提高T 细胞的免疫功能,治疗病毒性肝炎[2 ,3 ]和延缓某些老年病的发生与发展。Tα1 还有抗感染、抗病毒和抗肿瘤[4 ]的功效,尤其对癌症的免疫性治疗也具有一定的作用[5 ,6 ] 。 组织提取Tα1 受材料来源限制,工作量大、成本高;利用基因重组方法,小分子肽的表达比较困难,而且产率较低。 本研究采用新型保护策略的固相合成方法,拟建立一条操作简单、易于放大的化学合成路线,为Tα1 的批量生产和广泛临床应用奠定基础。

 

1 　实验部分

    所有Fmoc 保护氨基酸、Fmoc-Asn ( Trt)-WangResin、HOBt (1-羟基苯并三唑) 由美国ACT 公司提供,树脂取代值为015 mmol/ g。TFA、ConA 购自Sigma 公司。1640 培养液购自Gibco 公司。DCC(二环己基碳二亚胺) 及其他试剂为国产分析纯(AR) 。Tα1 对照品日达仙( Zadaxin) 为美国Sci-Clone 公司产品。手动固相多肽合成仪(自制) 。Laborota 4002/ WB 旋转蒸发仪( Heidolph , Ger-many) ,HP 1100 分析型高效液相色谱仪(美国惠普公司) , GradiFrac 色谱仪( Pharmacia ,瑞典) ,WatersPrep LC 4000 System 制备型高效液相色谱仪,Hi-tachi L - 8500 型氨基酸分析仪。

 

1.1 　Tα1 的全合成

    起始Fmoc-Asn ( Trt)-Wang Resin 按多肽顺序由C 端逐个向N 端延伸,各种Fmoc 保护氨基酸的侧链保护基分别为Thr ( tBu) 、Ser ( tBu) 、Asp(OtBu) 、Glu (OtBu) 、Lys (Boc) ,缩合剂为DCC ,并加HOBt 以活化氨基酸的羧基,每轮循环用体积分数为50 %的哌啶去除Fmoc ,肽链合成后,N 端乙酰化,最后用TFA 将肽从树脂上切割并去除所有保护基团。采用茚三酮定性显色法(Kaiser 法)和水杨醛定量自由氨基检测法对Tα1 合成过程进行监测。

 

1.1.1 　脱除Fmoc 氨基保护

    Fmoc2Asn (Trt)2Resin 110 g 以二氯甲烷(DCM)10 mL 浸泡后洗涤2 min ×3 ,抽干,加入哌啶2DCM(V∶V = 1∶1) 10 mL ,反应5 min ,抽干,再以同样的量处理一次,反应30 min ,反应在室温下进行,抽干后依次以DCM、EtOH、DCM (8～10 mL) 洗涤、抽干,取少量树脂(2～10 mg) 测定总氨基量(mmol/ g树脂) 。

 

1.1.2 　肽键的形成

    将上述树脂浸泡洗涤后抽干,加入425.5 mgFmoc2Glu(OBut )2OH 的DCM 溶液1.5 mL、76.6 mgHOBt 的DCM 溶液1.0 mL (加数滴DMF 溶液助溶) ,预平衡30 min ,加入含有206.3 mg DCC 的DCM溶液2.0 mL ,20 ℃反应过夜,抽干,洗涤,取少量树脂干燥至恒重,测定其残余氨基,计算缩合率。

 

1.1.3 　氨基末端乙酰化

    脱除多肽链最末端氨基酸的保护基后,再用10 mL醋酐2吡啶( V∶V = 1∶1) 于室温下处理树脂30 min ,洗涤、抽干,再以同样的量处理2 h ,使氨基末端乙酰化。

 

1.1.4 　脱除侧链保护及肽链下树脂

    在装有全保护二十八肽树脂的反应瓶中,加入3.0 mL DCM、3.0 mL TFA ,25 ℃反应60 min ,过滤,再加入TFA2DCM( V ∶V = 1∶1) 10 mL 反应20min ,树脂用TFA2DCM( V∶V = 1∶1) 洗3 次,合并滤液,滤液经旋转蒸发仪蒸发至最小体积,加入大量无水Et2O ,析出白色粉末状物体,离心沉淀,用无水Et2O 研磨5 次,真空干燥得白色固体粉末(粗产品) 1.263 g(理论产值为1.554 g) 。

 

1.2 　Tα1 的分析与纯化

    目标肽粗品先经DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换色谱纯化(pH = 8.0 的Tris2HCl 为缓冲液,离子强度为0～0.35 mol/ L NaCl 溶液进行线形梯度洗脱) ,部分收集后进行制备型RP2HPLC 纯化,采用C18 (Radial Pak ,100 mm ×8 mm id ,5μm ,100! ) 色谱柱,流动相A 为TFA2H2O( V∶V = 1∶999) ,流动相B 为流动相A2CH3CN( V∶V = 1∶9) ,线形梯度为10 %～35 %(φ) B ,60 min ,流速210 mL/ min ,检测波长2.4 nm。在相同的RP2HPLC 条件下,粗品谱图中极大峰的保留时间22.039 min ,与对照品日达仙色谱峰的保留时间22.084 min 基本一致。粗品肽经过二步纯化后,采用RP2HPLC 分析为单峰,保留时间为22.04 min。Tricine2SDS2PAGE[7 ]电泳检测结果表明:合成的粗品Tα1 与日达仙对应位置有单一条带,电泳扫描结果显示目标肽纯度为98.8 % ,合成总收率为33.2 %。氨基酸组成分析结果与理论值相等。

 

1.3 　体外活性测定

    采用3H2TdR 掺入法[8 ]测定Tα1细胞对小鼠淋巴细胞增殖活性。取小鼠脾脏在钢筛上研磨后用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,用PBS 洗后,悬于含10 %(φ) 小牛血清的1640 培养液中,向96 孔培养板中加入脾细胞4 ×105/ 孔和5 mg/ L 终浓度的ConA。每组3 个复孔, 并设对照组。37 ℃,体积分数为5 %的CO2 条件下培养6 h ,再加入不同浓度的日达仙和合成的Tα1 ,继续培养66h ,每孔加入3H2TdR 18.5 ×10 - 3GBq ,培养6 h ,收集细胞于玻璃纤维滤纸上,晾干后用液闪记数仪检测每分钟脉冲数值,计算增殖率。结果表明,合成的Tα1 与对照品日达仙相比无差异。

 

2 　讨论

    采用Fmoc 固相方法合成Tα1 ,粗肽经过纯化和分析得到预期活性产物。合成中,选用m2二乙烯苯交联的聚苯乙烯树脂为固相载体,从膨胀性和稳定性考虑1 %交联度较为合适。由于与树脂相连的肽的C 末端氨基酸为酰胺类型,故选用Wang 法制备对苄氧苯甲醇(HMP) 功能化树脂。在固相多肽合成中,氨基与侧链保护系统采用“正交保护法”,用机制完全不同的反应来选择性地断裂不同的键,体现了一种氨基保护和侧链保护相匹配的原则,即用新型的碱易裂解型保护基Fmoc保护α2氨基,用酸易裂解型保护基Boc 等保护侧链。而经典的固相多肽合成是用酸易裂解型保护基Boc 保护α2氨基。Fmoc 法用TFA 切除树脂和脱除侧链保护基,操作简便、条件温和,避免了Boc 法中强酸处理所带来的危险性和诸多副反应,既提高了反应的选择性,又使操作简单、安全,更易实现自动化。该工艺以Fmoc2Asn ( Trt)2Wang Resin 为合成起点,将Tα1 的羧端固定在二乙烯苯和苯乙烯共聚树脂上,向氨基端逐步递加、延长肽链,每一步反应较易进行,消旋化的可能性小,但要求每步反应都应达到高产率,本工艺每步反应的缩合率为98.7 %。目标肽的粗品经离子交换色谱和制备型高效液相色谱分离后,SDS2PAGE 电泳分析为单一条带的产物,其氨基酸组成分析与理论值相等。由于多肽是用固相法合成,氨基酸的连接顺序固定,证明了合成Tα1 结构的正确。Tα1 是酸性很强的二十八肽,相对分子质量为3 108 ,等电点为4.2 ,N 端被乙酰化,含有大量的Asp 、Glu ,不含有甲硫氨酸、半胱氨酸和芳香氨基酸,氨基酸序列为:Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。其活性较已经开发上市的胸腺肽组分F5 提高10～1 000 倍。生物活性测定表明:Tα1 具有良好的免疫刺激活性,且与国外对照品日达仙有相当的剂量效应。目标肽Tα1 确有提高免疫功能低下动物的免疫能力,促进淋巴细胞增殖、成熟的作用。这将为进一步研究Tα1 的免疫调节机制及探讨其临床应用提供参考,特别对免疫调节剂配伍细胞因子的研究奠定基础。

 

参考文献:

[1 ] 　Li Chunlin , Zhang Ting , Saibara Toshiji , et al . Thymosinalpha 1 accelerates restoration of T cell-mediated neutral-izingantibody response in immunocompromised hosts [J ] .Int Immunopharmacol ,2002 ,2(1) :39 - 46.

[2 ] 　Lau GK,Nanji A ,Hou J , et al . Thymosin-alpha 1 and fam-ciclovir combination therapy activities T-cell response inpatients with chronic hepatitis B virus infection in immune-tolerant phase[J ] . J Viral Hepat ,2002 ,9(4) :280 - 287.

[3 ] 　Andreone P ,Cursaro C ,Gramenzi A , et al . In vitro effectof thymosin-alpha 1 and interferon-alpha on Th1 and Th2cytokine synthesis in patients with chronic hepatitis C[J ] .J Viral Hepat ,2001 ,8(3) :194 - 201.

[4 ] 　Shrivastava P ,Singh SM,Singh N. Effect of thymosin-al-pha1 on the production of nitric oxide by tumor-associatedmacrophages[J ] . Neoplasma ,2003 ,50(1) :47 - 53.

[5 ] 　Rasi G,Terzoli E , Izzo F , et al . Combined treatment withthymosin-alpha 1 and low dose interferon-alpha after
dacarbazine in advanced melanoma [ J ] . Melanoma Res ,2000 ,10(2) :189 - 192.

[6 ] 　Mitani M,Kuwabara Y,Kawamura H ,et al . Significance ofplasma thymosin alpha 1 measurements in gastric cancerpatients[J ] .World J Surg ,2000 ,24(4) :455 - 458.

[7 ] 　Shi Jihong ,Zhao Yongtong ,Zhang Yingqi , et al . Study onanalysing methods of low molecular peptides with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [ J ] . Prog Biotechnol ,2001 ,21(1) :38 - 41.

[8 ] 　Shi Jihong ,Zhang Yingqi ,Zhao Yongtong , et al . Cloning ,expression of thymosin alpha 1 gene in E. coli and its pu2rification and characterization [ J ] . Chin J Biochem MolBio ,2001 ,17(3) :344 - 349.

Study on Fmoc solid2phase synthesis andactivity of thymosin α1

HAN Xiang ,GU Jun ,YUAN Qing2lan ,GAN Yi2ru
( Department of Chemistry , Medical College of Chinese People′s Armed
Police Forces , Tianjin 300162 , China)

Abstract :Aim To synthesize thymosin α1 by the solid2phase method. Methods Peptide synthesis was performed manually by the stepwise solid2phase method using the base2labile Fmoc group for protecting the α2amino acid. The peptide was assembled on a p2alkoxybenzyl alcohol resin.And the peptide sequence was prepared employing Fmoc2 amino acid and Boc2protected Lys ,OtBu2protected Asp ,Glu , tBu2protected Ser ,Thr ,Trt2protected Asn as building blocks. The Fmoc group was removed with piperidine2DCM( V∶V = 1∶1) . The peptide resin was treated with TFA2 DCM( V∶V = 1∶1) ,and purified by ion2exchange chromatography and prepared RP2HPLC. The analytical strategies included the reaction of ninhydrin reagents with small samples of resin peptide and salicylaldehyde reagents testing methods were used to monitor solid2phase reactions and determine the structures of resin2bound compounds. Results The yield of the total synthesis was 3312 % ,based on the amino acid content of the starting Fmoc2Asn (Trt)2resin. The purity was range to above 9818 % ,the activity is equal to that of Zadaxin. Conclusion A strategy for the synthe2 sis of thymosin α1 was presented. This orthogonal protection strategy has bright prospects for peptide synthesis. Key words :medicinal chemistry ;preparation ;solid2phase peptide synthesis ;thymosin α1 ;Fmoc