导读：摘要：目的 探讨珍香胶囊对人宫颈癌的抗癌作用厦其机制。方法 建立人宫颈癌裸鼠移植瘤模型，分别应用TUNEL法和免疫组化SABC法观察不同浓度的珍香胶囊对裸鼠移植瘤凋亡指数(AI)增殖细胞核抗原阳性细胞指数 (PI)的影响。

摘要：目的 探讨珍香胶囊对人宫颈癌的抗癌作用厦其机制。方法 建立人宫颈癌裸鼠移植瘤模型，分别应用TUNEL法和免疫组化SABC法观察不同浓度的珍香胶囊对裸鼠移植瘤凋亡指数(AI)增殖细胞核抗原阳性细胞指数 (PI)的影响。结果 经珍香胶囊治疗后，高浓度组和中浓度组AJ分别为(2．83士I．52)％和(2．50±I．43)％均明显高 于阴性对照组的(0．78±0．31)％ (P<0．01，P<0．05)，而低浓度姐AJ为(0．87±0．27)％与对照组比较，差异元显著性 (P>0．05)；高浓度组和中浓度组P1分别为(63．58±9．31)％ 和(68．83±9．04)％均低于阴性对照组(84．42± 9．2．5)％(P<0．01)，而低浓度姐Pl为(79．25±8．53)％与对照组比较，差异元显著性(P >0．05)。 蛄论珍香胶囊 通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡而这副其抗人宫颈癌作用。
关键词：宫颈癌；珍香腔囊；凋亡；增殖细胞掇抗原；裸鼠
珍香胶囊是新近开发的抗癌中药Ⅲ类新药，2000年获得国家新药证书(国药证字：Z20000077)和批准文号(国药准字： Z20000123)。研究表明。珍香胶囊对小鼠移植性肉瘤S一180、 Ehrlich腹水癌和恶性淋巴瘤LⅡ等有明显的抗肿瘤作用，对裸鼠移植的人胃癌和食管癌也有明显的抗癌作用【l 】。提示珍 香胶囊可能有较广的抗癌谱。而有关珍香胶囊对裸鼠移植的人宫颈癌的抗癌作用，国内外均未见报道。现在裸鼠皮下接种人宫颈癌细胞株HeLa细胞，建立移植瘤模型，观察珍香胶囊对 移植瘤生长的抑制作用，并对其作用机制进行初步探讨。
1 材料和方法
1．1 材料人宫颈癌细胞株He 细胞购自中国科学院上海 细胞生物研究所细胞库；珍香胶囊(由汕头高新区华泰医药有 限公司出品，批号：010101)；顺铂(由山东齐鲁制药厂生产，批 号：010310)；BALB／C nu／nu裸鼠，鼠龄6—8周，体重培一23g，雌性，由厦门大学抗癌中心裸鼠室提供，动物饲养在SPF环境下，裸鼠所需的物品、饮水、标准饲料均须经高压蒸汽消毒后方可使用。
1．2 方法 1．2．1 细胞培养人宫颈癌细胞株HeLa细胞在RPMI一1640 培养液(含10％小牛血清、100U／ml青霉素、lOOU／ml链霉素)中培养至对数生长期，0．25％ 胰酶消化，制备单细胞悬液，调整浓度至2x107个／ml，即0．2ml中含4X106个细胞。
1．2．2 肿瘤细胞移植及给药治疗30只裸鼠右肩皮下接种HeLa细胞0．2ml／只。即4x106个细胞。将裸鼠随机分为4组， 每组6只。肿瘤接种2d后，开始治疗给药。珍香胶囊的高浓度组、中浓度组、低浓度组分别按4．8g／kg、2．4g／kg、1．2g／kg灌胃给药，每天1次，每次0．2rid，共36次；阳性对照(顺铂组)：按3mg／kg腹腔注射给药。每3d1次，每次0．2ml，共12次；阴性对照组给生理盐水灌胃，每天1次，每次0．2ml，共36次。未次给药后24h，处死动物，剥瘤称重。
1．2．3 移植瘤细胞凋亡及免疫组化的检测 细胞凋亡检测采 用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TdT—medi— ated Dutp nick end labeling，TUNEL)法。按细胞凋亡检测试剂盒说明书方法进行。阳性对照为在TdT处理前用DNA酶I作预 处理；阴性对照不经TdT处理。增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的检测采用SABC法，步骤按博士德 公司的即用型SABC免疫组化试剂盒说明进行。
I．2．4 结果判断凋亡及PCNA阳性细胞染色均为棕黄色，位于细胞核内。光镜下观察切片的显色反应，数5个以上高倍视 野，不少于1 000个细胞，计数阳性细胞数并以百分数表示，作为肝癌细胞凋亡指数(Apoptosis index，AI)及增殖细胞核抗原阳 性细胞指数(Proliferating cell nuclear antigen—positive nue~i cell index，PI)。
1．3 统计学处理实验数据以 ±s表示 差异显著性检验采用t检验，所有统计学计算由SPSSIO．0软件完成。
2 结果
2．1 药物对裸鼠移植瘤生长的影响治疗组肿瘤重量较生理盐水组明显减轻，珍香胶囊高、中、低三个剂量对裸鼠移植的人宫颈癌的抑瘤率分别为46．5l％ (P <0．O1)、32．56％(P<0．01)、15．50％(P>0．05)，而顺铂对裸鼠移植的人宫颈癌的抑瘤率为52．7l％(P<0．O1)，见表1。显示珍香胶囊对裸鼠移植的人宫颈癌有一定的抗癌作用，且在裸鼠可耐受的治疗剂量下，随着剂量增加，其抗癌疗效增加。
表1 不同荆量的挚香胶囊对人宫顼癌棒曩移植瘤生长的影响(±$)

注：与生理盐水组比较。 P<0．O1。 P>0．05；+：表示体重增加。一：表示体重减少。
2．2 TUNEL法检测珍香腔囊对官颈癌裸鼠移植瘤AJ的影响珍香胶囊高浓度组和中浓度组AJ均高于生理盐水组(P< 0．01)，而低浓度组AI与生理盐水组比较，差异无显著性(P> 0．05)。顺铂组AJ高于生理盐水组(P <0．01)(表2)。
表2 不同荆量的珍香胶囊对富颈癌裸鼠移植癯细胞^l和PI的影响(±·)

注：与生理盐水组比较。}P <0．01；} <0．05； P >0．05。
2．3 珍香胶囊对宫颈癌裸鼠移植瘤PI的影响珍香胶囊高浓度组和中浓度组PI均低于生理盐水组(P <0．01)，而低浓 度组PI与生理盐水组比较，差异无显著性(P >0．05)。顺铂 组PI低于生理盐水组(P<0．01)(表2)。
3 讨论
宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤，宫颈癌的治疗主要是放疗和手术。但对于宫颈癌局部晚期和早期巨大癌灶患者，最好先 行新辅助化疗(Neoadjuvant chemotherapy)]。在新辅助化疗方案中，加入毒副作用相对较小的抗癌中药对抗癌疗效的影响。目前尚未见相关临床循证医学证据。本研究证实，珍香胶囊对 裸鼠移植的人宫颈癌有一定的抗癌作用。这为进一步研究珍香胶囊在官颈癌新辅助化疗中的作用奠定了实验基础。凋亡(Apoptosis)或称程序性细胞死亡(Programmed cell death)是具有特殊形态学和生化改变的一种细胞死亡形式。细胞凋亡与肿瘤发生和抑制有密切关系。增加肿瘤细胞凋亡是 一条有效的治疗肿瘤的途径。本研究发现，高浓度和中浓度组 的珍香胶囊可诱导人宫颈癌裸鼠移植瘤细胞的凋亡增加。高浓度和中浓度组的裸鼠移植瘤的凋亡指数(AI)与生理盐水组 相比显著增加(P<0．01，P<0．05)，而低浓度组差异则无显 著性(P>0．05)；高浓度、中浓度组、低浓度组之间均差异无显 著性(P>0．05)。说明高浓度和中浓度的珍香胶囊可能通过 诱导宫颈癌裸鼠移植瘤细胞凋亡而达到抗宫颈癌的目的。增殖细胞核抗原(PCNA)是DNA多聚酶8的辅助因子，作 用于细胞的S期及与DNA修复相关的DNA合成过程，是DNA 合成不可缺少的因子，也是一种细胞周期调节蛋白。其表达随 细胞周期变化，在C。早期开始上升，S期达高峰，c2、M期持续下降，c0期维持在极低水平。在Gl／S转换期，PCNA发生磷酸化，再与DNA合成部位结合，激活DNA修复因子，促进细胞增殖[4】。PCNA可用来估计细胞的增殖活性。我们用免疫组化SABC法对人宫颈癌裸鼠移植瘤细胞核进行染色，各组免疫组化实验结果表明，高浓度组核中浓度组的增殖细胞核抗原阳性 细胞指数(PI)比对照组低(P<0．01)，低浓度组差异则无显著性(P >0．05)。推测高浓度和中浓度的珍香胶囊对人宫颈癌裸鼠移植瘤细胞生长的抑制可能是通过抑制PCNA蛋白的表 达．从而降低DNA多聚酶8的活性，干扰肿瘤细胞DNA的合成，阻断细胞进入s期而停止增殖。癌症的治疗目前尚缺乏特效药物。抑制癌细胞的恶性增殖，诱导癌细胞的正常凋亡，是药物治疗癌症的重要途径。本 研究表明，珍香胶囊通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡而达到其抗人宫颈癌作用，这为临床用药提供了科学依据。