【摘要】目的:探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清转化生长因子-β1(TGF-β1)在肝纤维化不同阶段的表达情况及其对肝纤维化诊断的价值。方法:采用酶联免疫吸附法(ELASA)检测32例CHB患者血清TGF-β1水平,放射免疫法(RIA)检测血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)、Ⅳ型胶原(CⅣ)水平,32例患者均进行肝组织活检,分析TGF-β1与肝组织纤维化程度分期和炎症活动度分级的关系以及与HA、LN、PⅢNP、CⅣ四项指标的相关性。结果:(1)CHB患者TGF-β1水平明显高于正常对照组(P<0.01),随肝纤维化程度的加重而升高(P<0.01),TGF-β1变化趋势与HA、LN、PⅢNP、CⅣ均呈正相关(P<0.01)。(2)按炎症活动度(G)分组,TGF-β1在G1~G4组水平明显高于G0组(P<0.01),但组间两两比较差异无显著性(P>0.05)。结论:血清TGF-β1表达水平与CHB患者肝纤维化程度密切相关,不受肝组织炎症程度的影响,在早期肝纤维化的敏感性高于HA、LN、PⅢNP、CⅣ,可作为早期肝纤维化的诊断指标。
【关键词】肝炎,乙型,慢性;转化生长因子-β1;肝硬化;诊断

肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝脏慢性损伤中,肝细胞外间质(hepatic extracellular,ECM)沉积或肝细胞干枯减少所导致的病理改变,长期HBV持续感染,反复炎症活动,可产生不同程度的肝纤维化[1]。临床上多年来一直以肝组织穿刺活检作为诊断的金标准,但这种检查存在创伤性、难以重复进行及取材误差等缺陷,所以我们需要能准确、方便并且无创伤的肝纤维化指标指导临床诊断及治疗。转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)在肝纤维化的发生发展过程中起着重要作用。本研究检测了32例慢性乙型肝炎(CHB)患者血清TGF-β1含量,同时检测血清透明脂酸酶(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)、Ⅳ型胶原(CⅣ)血清水平,与肝组织活检进行对比,以探讨TGF-B1与肝纤维化的关系及在早期诊断中的意义。
　　
1 对象和方法
　　
1.1 对象:随机选取我科和消化科2005年6月~2007年6月住院的CHB患者32例。男22例,女10例,年龄19~50(33.7±9.94)岁。诊断符合2000年全国传染病与寄生虫病学术会议修订的诊断标准,上述病例经血清学检查均排除了甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染。设30例体检正常人员为对照组,男19例,女11例,年龄18~47(33.2±10.5)岁,各组间性别及年龄分布差异无显著性(P>0.05)。具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 肝组织采集与保存:32例患者入院即在B超定位后行肝组织穿刺活检,肝穿刺针用16G肝穿针,肝组织长约1.5~2.0 cm,标本用甲醛固定,石蜡包埋,4 ℃保存。
1.2.2 血清采集与保存:肝穿刺前后2 d内抽取空腹不抗凝静脉血,血块凝缩后以3 000 r/min速度离心15 min,取上清液放置于-30 ℃冰箱冻存备用。30例体检正常人员抽血保存备用。
1.2.3 血清TGF-β1检测:采用酶联免疫吸附法,试剂由美国Rapid Bio公司提供。已稀释血清与标准品一起加入已包被抗人TGF-β1单抗的酶标板上,混匀10 s;加入Biotin anti-TGF-Betal,混匀30 s, 37℃温育30 min;反复洗涤反应板5次;加入HRP,混匀10 s,37 ℃温育30 min;洗板5次;然后加入TMB显色液,混匀10s后置于暗处温育20 min;最后加入终止液,混匀后15min内在酶标仪450 nm 处读OD值。以上均严格按操作步骤进行。
1.2.4 血清纤维化指标检测:采用放射免疫分析法,试剂由北京北方生物技术研究所提供,以上严格按照操作步骤执行。
1.2.5 肝脏病理组织染色:常规病理HE染色和肝组织胶原纤维染色(Masson三重染色)。炎症活动度及纤维化程度分级分期标准按照2000年《病毒性肝炎防治方案》[2]。
1.3 统计学处理:应用SPSS10.0版统计学软件。计量资料之间比较应用方差分析,分析前行方差齐性检验,指标之间的相关性采用直线相关分析。
　　
2 结果
2.1 肝组织病理分期分级结果:根据病理诊断将肝纤维化程度分为S1(8例)、S2(9例)、S3(9例)、S4(6例),将正常对照者拟定为S0期(30例);将炎症活动度分为G1(8例)、G2(10例)、G3(8例)、G4(6例),将正常对照者拟定为G0期(30例)。

2.2 肝纤维化各期及正常对照组血清TGF-β1、HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平:见表1。血清TGF-β1水平在肝纤维化S1、S2、S3、S4各期比正常对照组明显升高(P<0.01)。HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平在S2、S3、S4各期比正常对照组明显升高,而在S0与S1期之间差异无显著性(P>0.05)。
　　
2.4 血清TGF-β1水平与肝纤维化指标的关系:CHB患者血清TGF-β1水平与血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ之间均呈正相关,相关系数分别为0.828、0.803、0.760、0.810,P均<0.01。
　　
3 讨论
　　
血清TGF-β1水平在各期CHB纤维化患者均升高,且随着纤维化程度而加重。目前认为肝星状细胞(HSC)激活是肝纤维化形成的关键步骤,控制HSC激活机制、调节基质蛋白合成和降解因素已成为肝纤维化的研究焦点。TGF-β1是目前已知的最重要的促HSC活化因子之一[3],在正常情况下与其他细胞因子一起处于一种网络平衡状态[4],共同维持肝脏内环境的相对稳定。它可调节细胞外基质受体的表达,刺激细胞外基质的产生,还通过抑制胶原酶和蛋白酶的产生以及促进组织抑制因子如金属蛋白酶[5]、A2-巨球蛋白等前纤维蛋白溶酶抑制物的分泌而减少胶原的降解[6],从而使细胞外基质在肝脏大量沉积导致肝纤维化,所以TGF-β1是一种强有力的致纤维化因子。慢性乙型肝炎由于肝炎病毒持续存在,病毒直接作用和其介导的免疫病理损伤导致Kupffer细胞的大量浸润,肝细胞碎片激活Kupffer细胞使其分泌TGF-β1,TGF-β1进一步激活贮脂细胞和其他间质细胞大量分泌TGF-β1,造成恶性循环,ECM大量生成沉积,促使纤维化发生发展。另外CHB患者TGF-β1水平升高还可能与下列因素有关:(1)慢性肝炎受损的肝细胞、内皮细胞使血小板聚集释放更多的TGF-β1;(2)TGF-β1的灭活减少等。

本结果显示,随着肝纤维化程度加重,血清TGF-β1水平逐渐升高,且与血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ呈正相关关系。HA由间质细胞合成,主要经肝脏内皮细胞降解,因而反映肝脏纤维化程度和肝脏功能;LN由肝Ito细胞和内皮细胞合成,是基底膜的重要成分;PⅢNP、CⅣ主要反映肝脏纤维化发展的动态过程。血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ是肝脏基质代谢产物,其血清水平从不同侧面反映肝脏细胞外间质的代谢情况和肝纤维化进展情况,Plebani等提出HA、LN、PⅢNP联合组成慢性肝病肝纤维化血清学指标,我国学者采用上述指标及CⅣ组成联合检测谱,而本实验提示TGF-β1与此四项肝纤维化指标呈高度正相关,能较好的反映纤维化的程度,因此可作为预测肝纤维化的血清学指标[7]。实验结果显示血清TGF-β1水平在S1期即比正常对照组有明显升高,而HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平在S1期与S0期相比差异无显著性,可得出TGF-β1在反映早期肝纤维化方面比其余各项指标更敏感,与国内有关报道一致[8]。从肝组织炎症活动度分级来看,肝脏炎症活动时,血清TGF-β1水平明显增高(P<0.01),但在炎症各级之间差异无显著性(P>0.05),提示肝组织炎症的存在是促使TGF-β1表达的必要条件,肝脏的炎症、变性、坏死可刺激TGF-β1产生增加,但增加程度与肝细胞的炎症、坏死的程度无关。炎症坏死是肝纤维化的始动因素,而TGF-β1是加速肝纤维化发展的重要因素。因此,认为TGF-β1作为肝纤维化检测指标不受肝组织炎症程度的影响。本研究表明,血清TGF-β1水平与慢性乙型肝炎患者肝脏纤维化的存在和发展有密切关系,血清TGF-β1水平测定有助于肝纤维化病变程度尤其是早期肝纤维化的判断。在早期肝纤维化的诊断上敏感性优于HA、LN、PⅢNP、CⅣ,但不能作为判断慢性肝炎肝组织炎症活动的指标。