材料与方法

1药品、试剂与仪器

受试制剂:富马酸替诺福韦酯胶囊，300mg/粒(以替诺福韦酯计)，鹤岗市国有资本运营总公司和黑龙江龙宝药业有限责任公司委托哈药集团(三精)千鹤制药有限公司生产，批号:050112，参比制剂:替诺福韦酯片Viread@(商品名)，300mg/片(以替诺福韦酯计)，美国GileadSCienCes公司生产，批号:FBK242；替诺福韦对照品，含量为98.7％，由黑龙江龙宝药业有限责任公司提供；内标物为马来酸恩替卡韦，含量99.5％，北京市典范科技有限责任公司提供；甲醇和甲酸均为色谱纯，德国Mer—Ck公司产品；空白人血浆由第四军医大学西京医院提供Agilent1100液相系统(包括G1311A型四元输液泵，Gl313A型自动进样器，Gl316A型柱温箱和G1379A型脱气机)，美国Agilent公司；API4000型三重四极杆串联质谱仪，配备电喷雾离子源(TurboIonspray)，美国AppliedBiosystems公司；数据采集使用Analyst1.4.1软件，美国AppliedBiosystems公司；分析柱为DiamonsilC18柱，250mmx4.6film，5μLm(迪马公司)；预柱为C，保护柱，4mmx3.0mm，5μLm(美国Phenomenex公司)；CP225D型分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；ThermoBR4i型高速离心机(美国ThermoBR4i公司)；H一101型多功能漩涡混合器(上海康禾光电仪器有限公司)；TurboVapLV蒸发仪(美国Caliper公司)

2试验方案

18例健康男性受试者，年龄(32.44-2.8)岁，体重(64.04-2.7)kg，心电图、血压、肝肾功能及血尿常规检查均正常受试者无既往病史和药物过敏史，精神状态良好，试验前2周未用任何药物试验期间禁烟、酒、茶和含咖啡因、果汁类饮料及禁服用其他药物，避免剧烈运动所有受试者均签署知情同意书，试验方案经医学伦理委员会审批同意本试验为标准双周期交叉自身对照设计将受试者随机等分为甲、乙两组第1周期甲组口服受试制剂富马酸替诺福韦酯胶囊300mg，乙组口服参比制剂富马酸替诺福韦酯片300mg；第2周期甲组、乙组交换服药品种2次试验间隔时间为7d受试者前一晚人住I期病房试验当日晨埋置静脉留置针，采集空白血，然后于进标准餐后30min给予受试制剂富马酸替诺福韦酯胶囊1粒或参比制剂富马酸替诺福韦酯片1片，于服药后0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0，36.0和48.0h由前臂静脉取血4mL，肝素抗凝，离心10min(3500r·min)，分离血浆，于一20℃冰箱中冷冻在冷冻状态下由干冰保存运送至上海药物代谢研究中心测定

3血药浓度测定

3.1色谱条件流动相为甲醇一0.3％甲酸溶液(40:60)，流速为0.6mL·min，进样量为20μL，柱温为35℃

3.2质谱条件
离子源为电喷雾离子源(TurboIonspray)；源喷射电压为4500V；温度为450℃；离子源气体1(N，)压力为413.4kPa；离子源气体2(N2)压力为344.5kPa；气帘气体(N2)压力为68.9kPa；正离子方式检测；去簇电压(DP)为43V；扫描方式为多反应监测(MRM)，碰撞能量(CE)分别为35eV(替诺福韦)和25eV(思替卡韦)；用于定量分析的离子反应分别为m/z288一m/z176(替诺福韦)和m/z278一m/z152(恩替卡韦)；碰撞气压力为3psi；扫描时间为200ms在上述条件下测得替诺福韦和内标恩替卡韦的保留时间分别为4.28和4.12min，其色谱图见图1

3.3血浆样品的处理
取100L血浆，分别加入50L甲醇一水溶液(50:50)和50L内标溶液(200ng·mL)，混匀，加入200μL甲醇，涡流1min，放置5min，离心5min(1l000r·min)，取150μL上清液于10mL玻璃试管中，40℃空气流吹干，残留物加入150μL水溶解，涡流混合，吸取上清液20μL进样分析

3.4标准曲线的制备
精密量取混合空白人血浆100μL，加入替诺福韦标准系列溶液50μL，配制成相当于替诺福韦浓度为1.00，2.50，8.00，20.0，80.0，200，500和1000ng·mL的血浆样品，按“血浆样品处理”项下依法操作，每一浓度进行双样本分析，进样20μL，记录色谱图；以待测物浓度C为横坐标，待测物的峰面积与内标物的峰面积比值为纵坐标Y，用加权(W=1μL)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线，Y=l.61×10C一1.50×10(r=0.9980)根据标准曲线替诺福韦在1.01000ng·mL浓度范围内线性良好，其最低定量浓度为1.0ng·mL

3.5方法学评价
取混合空白人血浆100μL，按“标准曲线的制备”项下的方法配制低、中、高3个浓度(分别为2.50，80.0和900ng·mL)的质量控制(QC)样品分析，每一浓度进行6样本分析，连续测定3d，根据当日的标准曲线，计算QC样品的测得浓度根据QC样品结果计算本法的准确度与精密度，结果见表1

3.6质控样品测定
在测定样品的同时进行质量控制即配制药物浓度分别为2.50，80.0和900ng·mL的血浆样品，按“血浆样品的处理”项下操作，测定待测物的峰面积与内标物的峰面积，将其比值代人回归方程计算实测浓度，考察方法的稳定性结果显示质控样品的变异系数均在±15％内，符合实验要求

4数据分析采用BAPP2.0药物动力学软件计算药动学参数并进行生物等效性评价采用梯形法计算AUC0-48h值和AUC值；以半对数作图法计算K6和t1/2Ke；T和C，采用实测值；MRT=AUMC/AUC；按下式计算富马酸替诺福韦酯胶囊的相对生物利用度(F):F=AUC(受试制剂)/AUC(参比制剂)×100％

结果
1血药浓度一时间曲线及药动学参数

18例健康受试者随机交叉单剂量口服受试制剂和参比制剂各300mg后的平均血药浓度一时问曲线图见图2，药动学参数计算结果见表2

2生物等效性评价

采用中国药科大学杨劲主编的BAPP2.0药物动力学软件，对主要药动学参数经对数转换后进行方差分析，并进一步采用双单侧t检验和(1—2α)置信区间法进行生物等效性评价，其中T采用非参数检验法统计分析结果表明:替诺福韦的AUC和C均拒绝生物不等效假设受试制剂中，替诺福韦AUC的90％置信区间为参比制剂相应参数的82.3％92.2％，C的90％置信区间为参比制剂相应参数的71.5％84.8％，但受试制剂T比参比制剂延长根据AUC和C的统计结果，可判定2制剂具有生物等效性

讨论

本试验采用了灵敏度高、专属性强的HPLC/MS/MS法测定了人血浆中替诺福韦的血药浓度，建立的方法简便、准确、精密度高、重现性好样品预处理仅需用甲醇沉淀后，即可进样分析，操作简单，可避免反复萃取造成回收率偏低由于采用串连质谱测定，可消除血浆中其他杂质的干扰，方法灵敏度完全满足实际应用的需要替诺福韦酯的临床应用剂量为300mg，qd，因此本试验确定的给药剂量为300mg由于替诺福韦酯空腹给药生物利用度较低，仅为25％，进餐后给药可使生物利用度提高约40％，因此本试验采用进统一标准餐后给药

本试验测得替诺福韦的主要药动学参数与文献报道’基本一致，但2种制剂的血药浓度一时间曲线和药动学参数在不同受试者仍存在一定差异而在制剂间和周期间无显著性差异2种制剂的C，AUC经对数转换后，进行方差分析及双单侧t检验和90％置信区间法进行生物等效性评价，其中采用非参数检验法结果表明，替诺福韦的AUC堋和C均拒绝生物不等效假设但受试制剂的较参比制剂延长，这有可能与剂型的改变有关总之，根据AUC和C的统计结果，可以判定2种富马酸替诺福韦酯制剂在人体内生物等效.