摘要　
运用吖啶橙（AO）／溴乙锭（EB）染色法检测阿糖胞苷（Ara-c）、高三尖杉酯碱（HHT）体外诱导临床初发及复发／难治急性非淋巴细胞白血病（ANLL）患者的白血病细胞凋亡，观察细胞凋亡指数与临床疗效的关系。结果显示初治ANLL药物诱导组凋亡率明显高于复发／难治组，初治组完全缓解（CR）者凋亡指数明显高于未缓解（NR）者。说明凋亡与耐药、凋亡与临床疗效有一定的关系。
A Study of Apoptosis on Non-lymphocytic Leukemia Cells Induced byCytosine Arabinoside and HomoharringtonineChen Lijuan et alDepartment of Haemotology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University

Abstract 　Using acridine orange (AO)/ethidium bromide(EB) staining, the apoptosis of leukemia cells from acute non-lymphocytic leukemia patients, which was induced by cytosine arabinoside (Ara-c) or/and homoharringtonine (HHT), was tested. The results showed that the apoptosis rates of initial ones were higher than those of relapsed/refractory ones, while apoptosis indexes of initial cases in complete remission were much higher than those of ones in non-remission. It suggested that apoptosis might be related to the drug resistance of leukemia cells and the clinical curative effects of chemotherapy.

Key words 　Apoptosis Acute non-lymphocytic leukemia Clinical curative effects Drug resistance

细胞凋亡是一种不同于坏死的细胞死亡形式，细胞凋亡与白血病治疗之间的关系已成为国际上研究的热点。本文主要研究Ara-c、HHT体外诱导临床初发及复发／难治白血病细胞凋亡，探讨细胞凋亡指数与耐药、临床疗效的关系。

材料与方法

一、对象

ANLL患者来源于本院血液科门诊及住院病例（15例）以及外院血液科已确诊的病例（13例），均符合FAB协作组白血病分类标准。其中初治组13例，复发／难治组15例（复发7例，难治8例）。难治病例系指经标准化疗方案化疗两个疗程不缓解者。复发病例指化疗后获得CR又出现下列之一项者：（1）骨髓原粒细胞Ⅰ型＋Ⅱ型（原单＋幼单）＞5％且＜20％，经过有效抗白血病治疗1个疗程仍未能达到骨髓完全缓解标准者；（2）骨髓原单＋幼单＞20％者；（3）髓外白血病复发者。

二、方法

1.患者细胞培养　取患者抗凝骨髓2ml或静脉抗凝血5ml经Ficoll分离单个核细胞，取5×106个细胞于1640培养液（5ml）中悬浮培养，置37℃、5％CO2浓度及饱和湿度的恒温箱中悬浮培养，12小时后，分别加入Ara-c、HHT和Ara-c＋HHT（Ara-c、HHT的终浓度分别为10μg／ml、80ng／ml），诱导培养12小时。

2.吖啶橙（AO）／溴乙锭（EB）染色及结果观察［1］　取上述诱导培养的细胞悬液100μl加入AO／EB染料4μl，混匀，置一滴于载玻片上，上覆盖玻片，在荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞，核染色质呈固缩状、片段状或小珠状示凋亡细胞，核染色质呈正常结构示非凋亡细胞。细胞凋亡率由下式计算：

×100％

3．临床疗效判断　详见全国白血病化学治疗讨论会急性白血病疗效判断标准［2］。

4.统计学方法　凋亡率经变量转换（Y＝arcsin）后行方差分析。

结果

初治13例经临床化疗后获得CR7例，部分缓解（PR）1例，NR5例。15例复发／难治组，仅1例经去甲氧柔红霉素＋阿糖胞苷方案化疗3次后达CR，1例经HA（HHT＋Ara-c）方案化疗后PR，余均为NR，详见表1。

表1　初发、复发／难治ANLL患者的临床疗效

组别 例数 CR PR NR
初　发　组 13 7 1 5
复发／难治组 15 1 3 11

由患者的凋亡指数及临床疗效（见表2、3）可得出以下结论：（1）初治组与复发／难治组凋亡率各诱导组方差分析均有显著性差异（P＜0.05），复发／难治组经Ara-c、HHT诱导后白血病细胞凋亡指数明显低于初发组；（2）初治组获得CR者与NR者凋亡指数间有显著性差异（P＜0.05），CR者凋亡指数明显高于NR者。

表2　初发、复发／难治ANLL患者的平均凋亡率
组别 例数 各药物诱导平均凋亡率（％）
对照 Ara-c HHT A＋H
初　发　组 13 3.85 41.85 42.31 53.88
复发／难治组 15 2.10 16.63 19.57 27.43

表3　初发ANLL患者CR组与NR组平均凋亡率

别 例数 各药物诱导平均凋亡率（％）
对照 Ara-c HHT A＋H
CR 7 3.50 58.00 52.93 64.86
NR 5 3.60 19.80 29.10 40.10

讨论

细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种主动死亡，其检测方法有多种，AO／EB荧光染色不仅易于识别凋亡细胞的存在，而且能计算出受检细胞群体中细胞凋亡的发生率，是一种半定量方法，此法简便、经济，便于开展。

ANLL是成人急性白血病最常见的类型，国内常用的化疗方案为HA方案，过去认为HHT、Ara-c的作用机制大剂量时是细胞毒作用，小剂量为诱导分化作用［3，4］，本研究证实二者具有诱导ANLL白血病细胞凋亡的作用。

本研究将ANLL患者分成初发及难治／复发两组，复发／难治组患者经Ara-c、HHT诱导的白血病凋亡指数均低于敏感者，很符合所谓的耐药可被视为抗调亡的推论。
抗凋亡与下列机制有关：
（1）与药物结合的受体发生突变；
（2）调控细胞凋亡的基因表达异常及突变，抑制细胞凋亡的基因如BCL-2基因、BCR／ABL融合基因、PML／RARα基因等表达水平增加，野生型p53基因突变致突变型p53基因表达水平增加；
（3）细胞因子的刺激作用。而与多药耐药基因mdr1、mdr3基因无关［5］。

初治ANLL经化疗达CR者本实验证实其白血病细胞凋亡指数明显高于NR者，尽管例数较少，尚有待进一步积累，但结果提示凋亡指数与临床疗效呈现正相关，今后可作为判断临床预后的指标之一，亦可用于新药筛选。

作者设想在难治及耐药患者，为了增强药物的敏感性，可运用凋亡学说原理，在治疗过程中有目的地调控诱导白血病细胞凋亡的各种因素，如上调诱导细胞凋亡的基因(野生型p53基因)，下调抑制凋亡的基因（BCL-2基因），加用促进细胞凋亡的细胞因子（TNF、TGF-β），清除抑制细胞凋亡的细胞因子（GM-CSF、G-CSF、IL-3等），以增强化疗药物诱导细胞凋亡的效应，此将为克服复发／难治性白血病提供崭新的治疗方案。

参考文献

［1］　Wang chenya, et al. CMJ 1996；109：537．

［2］　全国白血病化学治疗讨论会急性白血病疗效标准．中华血液学杂志 1988；9：183．

［3］　Lotem J, et al. Blood 1992；80：1750．

［4］　李林．药学学报 1994；9：667．

［5］　Soumaga ER, et al. Blood 1993；82：3452．