达那唑体外对子宫内膜异位症患者腹腔巨噬细胞释放细胞因子的影响及其与胞浆游离钙浓度的关系

刘义　罗丽兰　赵海波　胡清华　刘晨红

【摘要】　
目的　了解达那唑体外对子宫内膜异位症（内异症）患者腹腔巨噬细胞释放细胞因子的影响及与胞浆游离钙（［Ca2+］i）浓度的关系。方法　将浓度分别为10 μg/L、100 μg/L、1 000 μg/L的达那唑加入14例内异症不孕患者和11例盆腔正常的不孕患者（对照）的腹腔液中进行培养，用双抗体夹心法检测腹腔巨噬细胞培养上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素6（IL-6）的水平。同时应用Frua 2测定另10例内异症、8例对照患者的腹腔巨噬细胞［Ca2+］i水平。结果　与对照者相比，内异症患者腹腔巨噬细胞释放TNF-α和IL-6的能力明显增强（P<0.01），其［Ca2+］i水平也明显升高（P<0.01）。体外达那唑浓度达到100μg/L时，内异症患者腹腔巨噬细胞培养上清液中TNF-α和IL-6的水平显著降低（P<0.01），其［Ca2+］i也显著降低（P<0.01）。结论　达那唑体外能明显抑制内异症患者腹腔巨噬细胞活性。其作用与降低细胞内［Ca2+］i水平有关。
【关键词】达那唑；　子宫内膜异位症；　巨噬细胞；　细胞活素类；　钙
In Vitro Effect of Danazol on Cytokine Production of Macrophages in Peritoneal Fluid of Infertile Patients with Endometriosis and Its Relationship with Cytosolic Free Calicum Concentration
LIU Yi
（Department of Obstetrics and Gynecology, Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022, China）
LUO Lilan, ZHAO Haibo, et al.
【Abstract】　Objective　To investigate in vitro effect of danazol on cytokine production of macrophages in peritoneal fluid from infertile patients with endometriosis and its relationship with cytosolic free calicum (［Ca2+］i) concentration. Methods　Pertitoneal macrophages were obtaind from 14 cases of 24 infertile women with endometriosis (EM group) and 11 cases of 19 infertile women with normal pelvis (control group). Danazol was added to peritoneal macrophages culture reaching final concentrrations of 10 μg/L,100 μg/L,1 000 μg/L respectively. Tumor necrosis factor α(TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) levels in macrophage supernatant were detected by enzyme linked immunoassay. The ［Ca2+］i of cultured peritoneal macrophage and its changes after danazol addition were also studied. Results　In EM group TNF-α and IL-6 levels in peritoneal macrophage supernatant and ［Ca2+］i of macrophages were elevated significantly as compared with those in control group. When danazol was added to the cell culture and reached 100 μg/L of concentration, the levels of TNF-α and IL-6 in cultured macrophage supernatant and the ［Ca2+］i of macrophages in EM group decreased significantly (P＜0.01). Conclusion　It is suggested that danazol may exert its suppressive effect on endometriosis by inhibiting cytokine release of peritoneal macrophages and may related to decline of ［Ca2+］i concentration.
【Key words】　Endometriosis;　Danazol;　Macrophages;　Cytokines;　Calicum
近年来的研究表明，达那唑的细胞免疫调节作用可能为治疗子宫内膜异位症(内异症)的机理之一。本研究观察达那唑体外对内异症患者腹腔巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的影响，探讨其作用机理。

资料与方法

一、研究对象

选择1997年7月至1998年7月在我院妇产科行诊断性腹腔镜检查的不孕妇女43例，根据术后诊断分为两组。内异症组24例，年龄23～34岁，按美国生育协会(AFS)修正标准［1］分期，其中Ⅰ期19例、Ⅱ期5例，术前未经任何治疗；对照组19例，年龄22～36岁，腹腔镜检查为正常盆腔，诊断为不明原因不孕。两组患者的年龄、不孕时间及腹腔镜检查时的月经天数均无显著差异。

二、方法

1.腹腔液的采集和处理：在腹腔镜直视下通过吸管抽取子宫直肠凹和子宫膀胱陷凹腹腔液，立即置于肝素化无菌离心管中，以2 000 r/min离心10 min，去除上清液，管底沉淀以4 ml Hanks液重新制成细胞悬液。将细胞悬液按1∶1比例加在淋巴细胞分离液的液面上，用水平离心机2 000 r/min离心20 min，吸取中间富含淋巴细胞的灰白色层(其中90%以上为巨噬细胞)。用Hanks液洗涤2～3次，计数。

2.巨噬细胞的培养：内异症组14例、对照组11例的巨噬细胞用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液配制成密度为1×106/ml的细胞悬液。加入24孔细胞培养板内，1 ml/孔。置5%二氧化碳(CO2)、37℃培养箱孵育1 h，使巨噬细胞贴壁，用Hank′s液冲洗3次，除去未粘附的细胞。每孔加入含10 μg/ml细菌脂多糖(LPS)及10%小牛血清的RPMI 1640培养液1 ml，置5%CO2、37℃培养箱培养24 h，收集上清液，置-40℃保存待测。在内异症组腹腔巨噬细胞中加入含10 μg/ml LPS、10%小牛血清及终浓度分别为10 μg/L、100 μg/L、1 000 μg/L达那唑的RPMI 1640培养液1 ml，并设未给达那唑培养的巨噬细胞为对照。置5%CO2、37℃培养箱继续培养24 h，收集上清液，置-40℃保存待测。

3.TNF-α和IL-6的测定：采用双抗体夹心法，酶联免疫吸附测定试剂盒由第四军医大学免疫室提供。试剂敏感度为0.03 μg/L。将抗TNF-α(或IL-6)单克隆抗体以每孔400 ng包板，于4℃过夜，洗涤、封闭，加待测样本和标准TNF-α(或IL-6)，孵育、洗涤后加兔抗TNF-α(或IL-6)抗体，最后加底物邻笨二胺显色，以硫酸终止反应，经自动酶标阅读仪(美国Bio-Red公司产品)测定吸光度，并根据标准曲线求得待测样本TNF-α(或IL-6)含量。
4.巨噬细胞胞浆游离钙浓度［Ca2+］i测定：将内异症组中10例、对照组中8例患者的巨噬细胞，用含20%小牛血清的RPMI 1640培养液配制成密度为3×106／ml的细胞悬液。滴在25 mm×12 mm的小玻片上，置入5％CO2、37℃培养箱孵育1 h，使巨噬细胞贴壁，用Hanks液洗去未粘附的细胞，重新置于细胞培养液中。倒置显微镜下观察贴壁的巨噬细胞呈均匀单层贴壁状态。单层巨噬细胞［Ca2+］i测定按照本室建立的方法［2］。将贴壁细胞的玻片在 37℃磷酸缓冲液（PBS）中冲洗2次，将细胞放入含2.5 μmol／L、Fura-2／AM 的PBS溶液中，于37℃静置孵育45 min，用PBS冲洗2次。将玻片沿对角线垂直插入比色皿中，应用F-2000 型荧光分光光度计测定［Ca2+］i水平。同时在内异症组腹腔巨噬细胞中加入浓度为100 μg/ml的达那唑50 μl，测定用药后巨噬细胞［Ca2+］i水平。

三、统计学方法
计量资料比较采用t检验。
结果
一、两组患者巨噬细胞培养上清液中TNF-α和IL-6水平比较内异症组TNF-α和IL-6的水平分别为(7.2±0.6) μg/L、(0.15±0.08) μg/L，均高于对照组［(1.7±0.6) μg/L、(0.46±0.09) μg/L］，差异有极显著性(P＜0.01)。

二、达那唑体外对内异症患者腹腔巨噬细胞释放TNF-α和IL-6的影响加入达那唑后，内异症组腹腔巨噬细胞上清液TNF-α和IL-6 的水平呈不同程度降低。当达那唑浓度为10 μg／L时，TNF-α和IL-6水平虽有下降趋势，但与未给药者相比，差异无显著性(P＞0.05)；当浓度达到100 μg／L时，TNF-α和IL-6水平显著降低(P＜0.01)；当达那唑浓度为1 000 μg／L时，TNF-α和IL-6水平不再继续下降。见表1。
表1　体外达那唑对内异症患者腹腔巨噬细胞释放细胞

类 别	例数	TNF-α	IL-6
未给药	14	7.19±0.60	1.51±0.08
达那唑10 μg／L	14	6.56±0.97	1.46±0.07
达那唑100 μg／L	14	5.44±0.52*	0.48±0.11*
达那唑 1 000 μg／L	14	5.44±0.98*	0.48±0.79*

注: 与未给药者相比, *　P＜0.01
三、达那唑对内异症患者腹腔巨噬细胞［Ca2+］i水平的影响内异症组腹腔巨噬细胞内［Ca2+］i为(620±57) nmol／L，明显高于对照组的(100±5) nmol／L(P<0.01)。加入达那唑后，内异症组腹腔巨噬细胞［Ca2+］i显著下降［(217±37) nmol/L］（P<0.05），而对照组腹腔巨噬细胞［Ca2+］i水平无明显变化［(97±3) nmol/L］。
讨论
一、内异症患者腹腔巨噬细胞的活性与其［Ca2+］i的关系
细胞内第二信使系统是刺激引起反应的共同通路，细胞外信号大多经过细胞膜信号转换机制，转变为细胞内信号，即通过第二信使系统［Ca2+］i才能调节细胞的代谢和功能，启动、加强或抑制生理及病理效应。本研究结果显示，内异症患者腹腔巨噬细胞体外分泌TNF-α和IL-6的能力较对照明显增高（P＜0.01）。同时还发现，正常盆腔患者腹腔巨噬细胞［Ca2+］i水平为(100±5) nmol／L，与文献报道的静息状态下单核巨噬细胞内［Ca2+］i水平基本一致［3］，而内异症组腹腔巨噬细胞［Ca2+］i达到(620±57) nmol／L，较对照组显著升高(P＜0.01)。提示，内异症患者腹腔巨噬细胞活性增强，其机理涉及细胞内第二信使系统［Ca2+］i水平的变化。