[关键词]厄贝沙坦; 糖尿病; 肾脏肥大; 结缔组织生长因子; p27kip1；大鼠

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)是一种富含半胱氨酸的肝素结合性多肽,含有349个氨基酸,相对分子质量为36 000～38 000，属于即刻早期基因CCN(CTGF、Cyr61、nov)家族成员之一。1991年，Bradham等[1]首次在培养的人脐静脉内皮细胞中发现了这种细胞因子,进一步研究发现, CTGF广泛分布于人体各种组织、器官和体液中，具有促进细胞有丝分裂和胞外基质合成、趋化,促进细胞凋亡,调节血管生成等作用，是一个重要的致纤维化因子[2]。我们近期体外细胞培养实验亦证实，CTGF可能介导了AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞肥大。周期素激酶抑制剂p27增多，在高糖培养系膜细胞肥大及糖尿病(DM)肾小球细胞肥大中起重要作用[34]。临床及实验室的结果表明厄贝沙坦(irbsartan，Irb)对糖尿病肾病(DN)有保护作用，可减轻肾脏肥大程度和蛋白尿，保护肾功能[57]，但其确切机制尚不清楚。本研究拟在CTGF和p27水平探讨Irb治疗ＤＮ的作用机制，为防治DN提供一定的理论指导。

 1  材料与方法

1.1  模型建立和分组将体重为（180±20）g的清洁级雄性SpragueDawley（SD）大鼠[购自中国科学院上海实验动物中心，许可证号为SCXK（沪）20020010]随机分为对照(假手术)组（C组，n=32）、DN组（n=35）和糖尿病血管紧张素Ⅱ受体1拮抗剂Irb治疗组(DNI组，n=39）。每组再随机分为1、2、4 和8周4个亚组，分别于DM成模后1、2、4和8周处死。DN组与DNI组大鼠乙醚麻醉后行右肾切除术,1周后一次性腹腔注射STZ(Sigma公司)(溶于pH 4.0、0.1 mol・L-1枸橼酸枸橼酸钠缓冲液)50 mg・kg-1建立DM模型，Ｃ组大鼠仅给予0.1 mol・L-1枸橼酸枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。72 h后大鼠尾静脉采血测血糖,以随机血糖高于16.7 mmol・Ｌ-1作为大鼠DM模型建立标准。模型建立后即给予DNI组大鼠Irb(法国Sanofi公司提供)50 mg・kg-1・d-1灌胃，C组和DN组大鼠给予等量蒸馏水灌胃。实验期间,血糖过高的大鼠皮下注射胰岛素。室温18～20 ℃,湿度69%,12 h交替照明,大鼠自由饮水、进食。

1.2  观察指标和测定方法实验开始后每周称体重（BW）,尾静脉采血测外周血血糖(微量血糖仪,SureStep型,美国强生公司)。大鼠在处死前放入代谢笼准确收集大鼠24 ｈ尿量,3000 r・min-1离心10 min,去沉渣,-80 ℃保存,用液相免疫沉淀法测尿微量白蛋白(芬兰,Turbox试剂盒)。宰杀前戊巴比妥钠（30 mg・kg-1）腹腔注射麻醉，称BW，经股静脉采血，离心（3 500 r・min-1,10min）后吸取上清液-80 ℃保存，用HITACH 7150自动生化分析仪检测血、尿肌酐（Cr）。大鼠处死后迅速取出左肾，称肾重（KW）,经肾门冠状面取组织,10%中性甲醛固定,石蜡包埋,切3 μｍ厚片作普通肾脏病理学检查,行HE、六氨银染色,4%戊二醛固定液固定后透射电镜观察(JEOL JEM1200EX型)。

1.3  病理定量分析 HE染色切片,用CMIAS彩色图像处理系统(深圳瑞医科技发展有限公司),在400倍视野下每个标本测50个肾小球的直径和面积(AG)，并计算肾小球体积(ＶG)=4πｒ3/3(π=3.14,ｒ为肾小球半径)[8]。六氨银染色切片,用CMIAS彩色图像处理系统,在200倍视野下每个标本测200个肾小管面积(AT)。肾组织的免疫组化半定量分析方法为，每个标本在200倍图像的肾皮质区依次选40个视野,染色阳性部位的深浅及范围以平均吸光度表示，p27kip1染色阳性部位及范围以平均阳性细胞核数表示。

1.4  CTGF和p27kip1的表达 肾组织切片经二甲苯脱蜡、分级酒精水化后行免疫组化SP法(试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司)染色。一抗为羊抗人的CTGFＣ末端肽抗体(1∶100,Ｒ＆Ｄ公司),兔抗人的p27kip1多克隆抗体(1∶100,NeoMarkers公司)。所形成的复合物与AEC反应后呈红色阳性并经苏木素复染固定。每次染色时均同时以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。

1.5  统计学处理 用SPSS统计软件,组间数据用ANOVA分析。

2  结    果

2.1  各组大鼠血糖、BW变化实验期间DN、DNI组大鼠的血糖较Ｃ组明显升高且维持在一个较高水平(P<0.01)；C组大鼠BW增加迅速，DN组、DNI组大鼠BW增长缓慢，与对照组相比有显著性差异(P<0.01)，而同期DN组与DNI组之间BW与血糖相近，组间无显著性差异(P>0.05)。见表1。

2.2  各组大鼠尿蛋白排泄(测24hUalb)及内生肌酐清除率(Ccr)情况DM大鼠早期即有24hUalb和Ccr增加，DN组大鼠的24hUalb及Ccr在1周时与C组相比即有明显升高（P＜0.01），此后随着病程延长，DN组24hUalb及Ccr呈现逐渐增加趋势，与同期C组24hUalb及Ccr相比均有显著升高（均P＜0.01），而这种24hUalb增加和高滤过状态均可被Irb显著抑制（均P＜0.05）,但未恢复至正常水平,与C组相比仍增高(均P＜0.01)。见表1。

2.3  各组大鼠肾脏肥大指标变化情况在DM早期（1周时）DN组大鼠KW、肾脏肥大指数(KW/BW×1 000)、AG、VG、AT均较Ｃ组明显升高（表1）,提示DM早期即出现肾脏肥大，随着罹患DM时间的延长，DN组大鼠上述各项指标均逐渐增加(AT在4周时达到高峰)，而Irb可显著抑制肾脏的肥大。

2.4  各组大鼠CTGF和p27kip1的表达CTGF在各期Ｃ组大鼠肾小球有少量表达，小管几乎没有表达 (图1),在DM早期（第1周）大鼠肾小球和肾小管CTGF表达即较对照组显著增多，随着罹患DM时间延长CTGF在DM大鼠肾小球和肾小管的表达增加较C组更为显著，在肥大、扩张的小管尤甚，呈持续增高趋势（图1）。计算机辅助半定量分析显示，自第1周起，DN组肾小球、肾小管CTGF表达与对照组相比即明显增加（均P＜0.01）,且在观察期8周内，随病程延长CTGF表达逐渐增加。而Irb干预后，无论肾小球还是肾小管，CTGF表达与DN组比较均显著减少（均P<0.01）（图2）。在各期对照组大鼠肾小球和肾小管细胞核仅有少量p27kip1表达，DN大鼠早期（1周）p27kip1阳性细胞数即已显著增加,随着罹患DM时间延长p27kip1阳性细胞数增加较C组更为显著，在肥大、扩张的小管尤甚，呈持续增高趋势（图3）。半定量分析结果表明，各期DN组肾小球和肾小管中细胞核p27kip1阳性细胞比例（以%表示）较C组明显增加,观察期内，DN组p27kip1阳性细胞比例是C组的6~10倍（均P<0.01）。而Irb干预组p27kip1阳性细胞比例与DN组比较显著下降，分别抑制了30%~50%（均P<0.05），但与C组比较仍有差异（均P<0.01）（图4）。表1  各组大鼠血糖、BW、KW、KW/BW、AG、VG、 AT及24 h Ualb变化情况(略)与同一时间点的C组比较，1） P＜0.001， 2) P＜0.01，3) P＜0.05

2.5  相关分析 CTGF在近端肾小管的表达与p27kip1的表达呈明显正相关关系（y=1.7388x-0.0281, r=0.96,P<0.01），CTGF在小管的表达与24 hUalb（y=3.9364x-0.2605， r= 0.95，P<0.01）、AT（y=8.1009x+5.4072，r=0.94，P<0.01）以及CTGF在小球的表达与AG（y=8.4492x+2.6028, r=0.92，P<0.05）、VG（y=2.6158x+1.5767，r=0.86，P<0.05）也呈显著的正相关关系。

3  讨    论

DN是DM最常见且严重的并发症，在我国，由DM引起的终末期肾病(endstage renal disease，ESRD)逐年增加。肾脏肥大是DN早期特征性病理改变，最终导致蛋白尿和肾功能衰竭[9],但其机制目前尚未完全明了,一些细胞因子如血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）、TGFβ、血小板源性生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子1与其密切相关,高血糖、非酶糖基化产物和血流动力学紊乱均可刺激肾脏固有细胞通过自分泌和旁分泌方式合成和释放上述因子,影响肾脏细胞的增殖周期和细胞外基质的合成[10]。越来越多的证据表明,AngⅡ可促进CTGF的表达与合成[1113]。我们的前期研究也发现AngⅡ可直接并且呈时间、剂量依赖性地诱导体外培养的人肾近端小管细胞CTGFmRNA和蛋白的表达，而抗CTGF抗体可以明显改善由AngⅡ诱导的细胞肥大，抑制细胞内总蛋白含量的增加，而且这种抑制呈浓度依赖性增强[14]，AngⅡ所诱导的肾小管细胞肥大也可以被CTGF反义寡核苷酸所阻断。近来Reuperez等[15]将AngⅡ直接注入正常大鼠体内后发现，3 d后肾脏CTGFmRNA及蛋白表达增加，7 d后肾小球、肾小管、肾动脉CTGF过度表达，并且伴随有小管损伤和FN的沉积，在给予ARB后，CTGF和FN的过度表达及小管受损情况均得到明显的改善，在体外培养的系膜细胞和小管上皮细胞，AngⅡ均可通过AT1受体使CTGFmRNA及蛋白表达增加，而在给予CTGF反义寡核苷酸后又可减轻AngⅡ诱导的FN合成。本研究结果显示Irb可显著抑制STZ诱导的DM大鼠肾小球、小管CTGF表达，使VG、图1  各组大鼠肾脏CTGF的表达  SP×200图2  半定量分析示各组大鼠肾小管与肾小球CTGF表达情况 图3  各组大鼠肾脏p27kip1的表达  ×200图 4  半定量分析示Irb对各组大鼠肾脏p27kip1表达的影响AG、KW明显下降，肾小球基底膜（GBM）、肾小管基底膜（TBM）厚度也明显减小。这些结果均提示，CTGF可能是介导AngⅡ所致肾脏肥大的重要因素。细胞周期调节蛋白(CCRP)决定细胞是否增生肥大[16],而p27kip1是一种十分重要的负性CCRP。 Wolf等[3]、Shankland [16] 及国内梅小斌等 [4]的研究证明, p27kip1水平增高在高糖培养系膜细胞肥大及ＤＭ VG增大中起重要作用。有研究显示,高糖、AngⅡ以及其他因素通过激活PKC及部分依赖TGF β途径使系膜细胞、小管上皮细胞内CKI中的p27kip1蛋白表达增加[9，17]，阻止细胞由G1期进入S期，使细胞停顿在G1末期而发生肥大。本研究结果显示DM早期肾脏肥大的同时,小球、小管CTGF和p27kipl的表达也呈时间依赖性增加,且小管p27kipl的表达量与CTGF的表达量呈明显正相关关系，Irb明显抑制小球、小管CTGF和p27kipl的表达。本研究结果提示, AngⅡ与肾脏CTGF表达有关；CTGF介导早期肾脏肥大可能是通过促进p27kip1表达导致细胞周期阻滞实现的；DM大鼠早期使用AngⅡ受体拮抗剂Irb能够减弱 CTGF、p27kip1表达，明显抑制肾脏肥大，减少尿白蛋白排泄和GBM、TBM增厚，从而发挥肾脏保护作用。

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