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沙立度胺抑制乳腺癌细胞增殖的作用机制

2010-01-15 12:05:47 作者：新特药房来源：中国新特药网浏览次数：64 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 【摘要】目的研究沙立度胺抑制乳腺癌细胞增殖的机制。方法流式细胞仪检测沙立度胺对细胞凋亡和细胞周期的影响；半定量RTPCR方法观察沙立度胺对MCF7和MDAMB231细胞VEGF mRNA表达的影响。结 ...

【摘要】
目的研究沙立度胺抑制乳腺癌细胞增殖的机制。方法流式细胞仪检测沙立度胺对细胞凋亡和细胞周期的影响；半定量RTPCR方法观察沙立度胺对MCF7和MDAMB231细胞VEGF mRNA表达的影响。结果沙立度胺作用后的乳腺癌细胞在流式细胞分析的DNA直方图上显现细胞凋亡峰（亚G1期）；沙立度胺抑制两株细胞VEGF mRNA的表达。结论沙立度胺可能通过诱导MCF7和MDAMB231细胞凋亡以及抑制细胞VEGF mRNA表达从而抑制MCF7和MDAMB231细胞增殖。

【关键词】乳腺肿瘤；细胞系；沙立度胺；凋亡；内皮生长因子

Antiproliferation Effect and Its Mechanism of Thalidomide on Breast Cancer Cells in vitro

LI Shuqin1， JI Yanxia2，YANG Zhiyong2，LI Haiyan2， ZHANG Zhenjun2，JIA Jungang2，WAN Lianggang2

1.Department of Blood Oncology， Handan Central Hospital, Hebei 056001，China,2.Department of Radiation OncologyAbstract：Objective To investigate the antiproliferation effect and its mechanism of thalidomide on breast cancer cells in vitro.Methods （1）The influence of thalidomide on apoptotisis and cell cycle were detected in treated cells by FCM assay.（2）The effect of thalidomide on expression of VEGF mRNA in human breast cancer cell lines was determined by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) method.Results （1）Apoptotic cells were found in treated cells, the breast cancer cell presented the second period of G1 in the DNA histogram of FCM.（2）Thalidomide inhibited the level of VEGF mRNA expression.Conclusion The inducement apoptotic and inhibition the level of VEGF mRNA expression were the mechanisms of thalidomide on antiproliferation in breast cancer cell lines.

Key words：Breast cancer; Cell lines; Thalidomide; Apoptotic；Endothelial growth factor

近几年沙立度胺已用于多种肿瘤的Ⅱ期临床研究。在实验中我们观察到沙立度胺抑制乳腺癌细胞增殖的现象，遂进一步从沙立度胺对细胞周期的影响和对细胞血管内皮生长因子影响两方面研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株与材料

人乳腺癌细胞由河北医科大学附属第四医院科研中心保存。沙立度胺（±）Thalidomide，Sigma公司产品，批号093K461。溶于二甲基亚砜（DMSO）配制成50mg/ml浓度储存备用。Trizol Reagent为美国GIBCO/BRL公司出品；引物序列由上海生物工程公司合成。

1.2 细胞培养

将MCF7、MDAMB231细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，在37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 流式细胞技术检测细胞凋亡

根据MTT法检测结果[1]，设置溶剂对照组及实验组（沙立度胺100μg/ml，培养48h），制成单细胞悬液，离心去上清，冷乙醇固定，调整细胞浓度为每毫升1×106细胞，取1ml细胞悬液，加入1ml EB染液一步插入法进行DNA染色， 500目铜网过滤后上机测定。采用EB染色法分别测定各组细胞中的DNA含量变化及细胞凋亡情况。在DNA含量直方图上观察SubG1峰(凋亡细胞峰)是否出现。按下式计算凋亡指数(Apoptotic Index，APOI) ：APOI=(凋亡细胞数/所测细胞总数)×100%。

1.4 半定量RTPCR方法检测沙立度胺对乳腺癌细胞VEGF表达的影响

1.4.1 细胞总RNA的提取

取对数生长期的细胞，细胞密度为每个培养瓶2×106个，根据MTT法检测结果设置对照组及实验组（沙立度胺100μg/ml，培养48h），用Trizol Reagent提取细胞总RNA，紫外分光光度仪测OD260/OD280比值在1.6～1.7之间，根据OD260分别计算提取RNA的浓度。

1.4.2 半定量 RTPCR

利用RTPCR酶混合物试剂盒（含MuMLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶和核糖核酸酶抑制剂）通过一步法进行逆转录及PCR扩增。逆转录及cDNA扩增反应体系为： RTPCR酶混合物2.0μl，20×Buffer1.5μl，4×dNTP1.2μl，MgCl22.0μl，引物（上游、下游）各1μl，总RNA 2μg，蒸馏水定容到总体积30μl。VEGF引物序列：上游引物为 5′GAAG TGGT GAAG TTCA TGGA TGTC3′，下游引物为5′CGAT CGTT CT GT ATCA GTCT TTCC3′，产物有两种亚型VEGF121403bp、VEGF165515bp。βactin引物序列：上游引物为5′ATCT GGCA CCAC ACCT TCTA CAAT GAGC TGCG3′，下游引物为5′CGTC ATAC TCCT GCTT GCTG ATCC ACAT CTGG3′,扩增片段838bp。VEGF反应条件：37℃逆转录60min，94℃灭活MLV逆转录酶5min，PCR扩增35个循环，每个循环为：94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，72℃再延伸5min。βactin的反应条件：37℃逆转录50min，94℃灭活MLV逆转录酶5min，PCR扩增30个循环，每个循环为：95℃变性15s，60℃退火45s,72℃延伸45s，72℃再延伸7min。

1.4.3 半定量PCR扩增产物的定量分析

取5μl扩增产物，琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统分析图像，读取各产物条带的光密度值，VEGF mRNA表达相对值=VEGF吸光值/βactin吸光值。

1.5 统计学方法

数据以±s表示，用SPSS10.0软件对所有数据进行处理。两个独立样本组间均数比较用t检验，以Pearson相关分析VEGF mRNA两个亚型的相关性。以α= 0.05为检验水准。

2 结果

2.1 沙立度胺对乳腺癌细胞凋亡以及细胞周期的影响

100μg/ml沙立度胺作用48h的MCF7和MDAMB231细胞DNA直方图上的G1期峰前均显现亚G1期（细胞凋亡峰），100μg /ml沙立度胺作用细胞48h，MCF7细胞实验组凋亡率可达9.66%，对照组为3.37%，MDAMB231细胞实验组凋亡率可达11.18%，对照组为6.02%。实验组凋亡率均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。100μg/ml沙立度胺处理MCF7细胞48h，在G0/G1期、S期和G2/M期的细胞分别为63.44%、20.46%和16.30%，而未经药物作用的对照组G0/G1期、S期和G2/M期细胞分别为47.93%、35.06%和17.11%；100μg/ml沙立度胺处理MDAMB231细胞48h，在G0/G1期、S期和G2/M期细胞分别为61.15%、14.40%和24.45%，而未经药物作用的对照组G0/G1期、S期和G2/M期细胞分别为57.06%、18.33%和24.61%，该结果表明在沙立度胺作用下，G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞比例下降，多数细胞阻滞在G0/G1期。流式细胞仪分析见图1，表1、2。表1 沙立度胺作用于乳腺癌细胞的凋亡率细胞细胞周期的影响

2.2 沙立度胺对MCF7和MDAMB231细胞VEGF mRNA表达的影响

半定量RTPCR结果分析表明：药物浓度100μg/ml，沙立度胺作用两株细胞48h，统计分析组间VEGF mRNA相对值差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表3、图2～3。表3 沙立度胺组与对照组对MCF7及MDAMB231细胞VEGFmRNA表达的影响

3 讨论

MTT法检测结果表明沙立度胺的IC50(inhibitory concentration giving 50% inhibition)接近50μg/ml，而IC50<20μg/ml时，方能判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用[2]。既然按照此标准不能判定沙立度胺对乳腺癌细胞有杀伤作用，那么它是通过哪些机制来抑制乳腺癌细胞增殖的呢？

已有报道沙立度胺可以诱导骨髓瘤细胞凋亡，并可使细胞增殖阻滞于G1期[3，4]。是否也可以诱导乳腺癌细胞凋亡呢？于是我们采用了流式细胞术来检测沙立度胺是否有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用。细胞发生凋亡(apoptosis)时， DNA广泛降解、断裂， DNA断裂产生小分子量DNA(单、寡聚核小体)溢出胞外，于正常G0/G1细胞群前出现一个DNA低染细胞群，称“A0细胞群”或“亚G1细胞群”，即凋亡细胞群。实验结果显示，沙立度胺作用后，乳腺癌细胞在DNA直方图上的G1期峰前显现细胞凋亡峰亚G1期。100μg/ml沙立度胺处理细胞48h，MCF7实验组细胞凋亡率可达9.66%，高于对照组（3.37%），MDAMB231实验组细胞凋亡率可达11.18%，亦高于对照组（6.02%）。表明沙立度胺可以诱导乳腺癌细胞凋亡，诱导凋亡是其抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一。流式细胞仪分析显示沙立度胺使G0/G1期细胞增多，G1期又称DNA复制前期，可以产生rRNA、mRNA以及tRNA核蛋白体，为进入S期（DNA合成期）做准备。结果提示沙立度胺可以通过阻滞细胞DNA合成，进而抑制乳腺癌细胞增殖。

既然沙立度胺是一种血管生成抑制剂，D′Amato等[5]曾报道其抗血管生成作用可能与抑制VEGF和bFGF表达有关，而VEGF是调节血管生成和肿瘤细胞生长的重要因子，那么沙立度胺是否可以通过抑制VEGF生成，来发挥其抑制乳腺癌细胞增殖的作用呢？通常的VEGF即指VEGFA，其编码基因位于染色体的6P21.3，由8个外显子和7个内含子构成，由于mRNA不同的剪切形式，形成至少5种蛋白异构体，其中VEGF121和VEGF165是主要的异构体形式。在病理条件下，特别是肿瘤细胞中，VEGF无论是在mRNA的水平还是在蛋白质水平均有过量的表达，并可以直接刺激肿瘤细胞的增殖[6]。由MCF7乳腺癌细胞分泌VEGF的过表达能促进去卵巢的裸鼠乳腺癌的生长，提示 VEGF可以替代雌激素通过其他途径促进乳腺癌细胞的生长[7]。实验采用半定量RTPCR方法，分析沙立度胺对乳腺癌细胞VEGF mRNA的影响。结果表明100μg/ml沙立度胺能抑制MCF7和MDAMB231细胞的VEGF mRNA表达。实验选用的两株经典的乳腺上皮癌细胞（MCF7和MDAMB231）生物学行为具有明显的不同，如MCF7细胞ER、PR受体均阳性，基因型为野生型p53。而MDAMB231细胞ER、PR受体均阴性，基因型为突变型p53。沙立度胺在一定浓度范围内对MCF7和MDA231细胞增殖均有抑制作用，实验结果显示其作用机制与诱导细胞凋亡和抑制乳腺癌细胞VEGF mRNA表达有关，而且不受细胞生物学行为的影响，这对于ER和PR阴性乳腺癌患者来讲，无疑是一个有吸引力的治疗手段，而且相对于昂贵的血管内皮抑制剂单克隆抗体，沙立度胺价格低廉，更适用于发展中国家，有良好的开拓前景。

【参考文献】
［1］季艳霞，姜达，康振桥.沙立度胺对人乳腺癌细胞血管内皮生长因子亚型表达的影响[J].肿瘤学,2005,54(1)：2628.

[2] 张均田.现代药理实验方法[M].第1版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1998.818.

[3] Hideshima T,Chauhan D,Shima Y,et al.Thalidomide and its analogs overcome drug resistance of human multiplemyelo maceloma cells to conventional therapy[J].Blood,2000,96(9): 29432950.

[4] Aseffa A,Dietrich MA,Shannon EJ.Effect of thalidomide on apoptosis of lymphocytes and neutrophils[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,1997,19(3):313326.

[5] D′Amato RJ，Loughnan MS，Flynn E，et al. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（9）：40824085.

[6] Stephens T, Fillmore B. Hypothesis: thalidomide embryopa thyproposed mechanism of action[J].Teratology,2000,61(3):189195.

[7] Guo P,Fang Q,Tao HQ,et al.Overexpression of vascular endothelial growth factor by MCF7 breast cancer cells promotes estrogenindependent tumor growth in vivo[J].Cancer Res,2003,63(15):46844691.