当前位置：药品说明书与价格首页 >> 抗肿瘤药 >> 诊疗手册 >> 肿瘤用药常识 >> 亚砷酸对人肺腺癌细胞的体外抑制作用及机制研究

亚砷酸对人肺腺癌细胞的体外抑制作用及机制研究

2010-04-02 10:34:52 作者：新特药房来源：互联网浏览次数：52 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 【摘要】【目的】探讨中药砒霜有效成分亚砷酸的体外抑瘤作用及机理。【方法】以体外培养的人肺腺癌细胞株（LAC）细胞为研究对象，选用对数生长期细胞，培养?24?h?后，分别加入不同浓度的亚砷酸（0 ...

关键字：砒霜／药理学；亚砷酸／药理学；肺肿瘤／中药疗法；细胞凋亡；细胞培养；基因表达调控

【摘要】
【目的】探讨中药砒霜有效成分亚砷酸的体外抑瘤作用及机理。
【方法】以体外培养的人肺腺癌细胞株（LAC）细胞为研究对象，选用对数生长期细胞，培养?24?h?后，分别加入不同浓度的亚砷酸（075、10、15、?20?mg／Ｌ)，并设模型对照组；采用倒置相差显微镜观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测LAC细胞的生长抑制率；酶联免疫吸附（ELISA）法检测p53基因的表达变化情况。
【结果】各浓度亚砷酸均能使LAC细胞发生凋亡特征性形态改变，能显著性抑制LAC株的增殖，且呈现一定的时间效应关系，并能显著性升高p53基因的含量（均Ｐ＜００５或Ｐ＜００１）。
【结论】亚砷酸抗肺癌的作用可能是通过上调p53基因的表达来诱导LAC肿瘤细胞凋亡，从而抑制LAC细胞的增殖，这可能也是中药砒霜能治疗肿瘤的机理之一。

【关键词】砒霜／药理学；亚砷酸／药理学；肺肿瘤／中药疗法；细胞凋亡；细胞培养；基因表达调控

Invitro Inhibitory Effect of Arsenic Trioxide on Human Lung Adenocarcinoma and Its Therapeutic Mechanism

YE Xiaowei，CHENG Ting，CHEN Yao，YE Huili，CHEN Linxiang(The First Affiliated Hospital，Guangzhou University of TCM，Guangzhou 510405，China)Abstract：
　　
【Objective】To explore the therapeutic mechanism of arsenic trioxide （AS２Ｏ３），the active component of arsenolitum in inhibiting tumor.
　　
【Methods】Human lung adenocarcinoma cells (LAC) at logarithmic growth phase were cultured in vitro for 24 hours，and then were cocultured with arsenic trioxide (AS2O3 ) in the dosages of 075，10，15 and 20?mg/L respectively.Meanwhile，model control group was set up.The morphological features of LAC in different groups were observed under reverse microscope，growthinhibitory rate of LAC was examined by methylthiazolyltetrazolium (MTT) assay，and the expression of p53 gene was detected by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) method.
　　
【Results】AS2O3 in different dosages obviously inhibited the proliferation of LAC in a timeeffect manner，and markedly increased the expression of p53 gene （Ｐ＜００５ or Ｐ＜００１ compared with the model group）.
　　
【Conclusion】The therapeutic mechanism of arsenolitum for tumor may be associated with the inhibition of LAC proliferation by AS2O3 through upregulating p53 gene expression.
Key words：ARSENOLITUM/pharmacology；ARSENIC TRIOXIDE/pharmacology；LUNG NEOPLASMS/TCD therapy；CELL APOPTOSIS；CELL CULTURE；GENE EXPRESSION REGULATION

中药砒霜（三氧化二砷，AS２Ｏ３）及砷制剂对肿瘤的治疗是近年来的研究热点，特别是对白血病的治疗已为人们所关注。砷作为抗肿瘤药物在我国已有百年历史，中药传统方剂青黄散、十味丸等治疗不同类型的白血病确有一定疗效，经鉴定其中有效成分为含砷中药。近年来的实验与临床研究发现，三氧化二砷对肺癌有良好的抗肿瘤作用，其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增殖、逆转耐药等有关［1-5］，但其治疗肺癌的确切机理未完全阐明。近年来临床上将亚砷酸（化学成分：三氧化二砷）用于治疗肺癌已取得一定的效果，故本研究试图通过体外培养人肺腺癌细胞株（LAC）作为研究对象，观察亚砷酸对LAC细胞形态及p53基因表达的影响，以了解亚砷酸用于治疗肿瘤的机理。
　　
１材料和方法

11细胞株、药物与试剂LAC细胞株由广州军区总医院分子肿瘤学研究所细胞室提供；亚砷酸注射液，批号：19990191，由哈尔滨伊达药业有限公司生产；胎牛血清（FSC）为中国医学科学院血液学研究所产品；RPMI1640培养基、乙二胺四乙酸（EDTA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）均为GIBCO公司产品；人p53定量酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购自上海森雄科技实业有限公司。

12细胞培养将冻存的LAC株按常规方法复苏，接种于RPMI1640培养液（含体积分数为10％FSC、100?U/mL青霉素、100?mg/mL链霉素）中，于37℃、体积分数为5%CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每?2～３?d?传代1次；传代时用?025?g／Ｌ?的胰蛋白酶和?02?g／ＬＥＤＴＡ?消化?2～３?min，以培养液吹打制成细胞悬液，接种至?50?mL?培养瓶，至细胞生长旺盛后，取对数生长期细胞用于实验。

13细胞形态观察选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用1640液稀释成2×105?/mL浓度的细胞悬液接种至50?mL培养瓶；置于37℃、体积分数为5％CO2及饱和温度的恒温培养箱中培养?24?h?后，实验组分别加入各种浓度（075、10、15、20?mg/L）的亚砷酸，模型组则加入不含药的细胞培养液。置于CO2培养箱中培养?48?h?、?72?h?后，将培养瓶置于倒置相差显微镜下进行细胞生长状态的观察。

14MTT比色法检测LAC肿瘤细胞的生长抑制率选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用RPMI1640培养液稀释配成1×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔接种100?μL，在ＣＯ２培养箱中培养?24?h?后，实验组加入不同浓度的亚砷酸（075、10、15、20?mg/L）100?μL，模型对照组则换含等体积溶剂的培养基，每组设16孔；每日更换新鲜培养液，以维持亚砷酸药液浓度不变；在ＣＯ２培养箱中培养?24、48、72?h?后每孔加入20?μL MTT无血清培养基，37℃继续培养?4?h?后，每孔加入100?μL DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上检测492?nm处各孔吸光度（Ｄ）值，计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率：p抑制／%＝（1－Ｄ实验组／Ｄ模型组）×100％。

15人p53基因的检测选用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化后，采用培养细胞计数法，用1640培养液稀释成2×105/mL浓度的细胞悬液接种至50?mL培养瓶中；在ＣＯ2培养箱中培养?24?h?后，实验组分别加入各种浓度（075、10、15、20?mg/L）的亚砷酸，模型对照组则加入不含药的细胞培养液；置ＣＯ２培养箱中培养?48?h?后收集细胞，过滤后离心，吸取细胞培养上清液用于实验。按p53?ELISA试剂盒操作要求，依次加样、洗涤、孵育、洗涤，于酶标仪492?nm波长处比色。测定样品的吸光度值。

16统计学方法数据采用SPSS 100软件包处理。
　　
2结果

21形态学结果在倒置显微镜下可见各实验组中的细胞贴壁能力减弱，由贴壁生长而逐渐脱落，悬浮于培养液中，贴壁细胞数量减少，细胞形同变圆，部分细胞皱缩，体积缩小，出现核固缩，部分核碎裂。其中，尤以药物作用?72?h?、10?mg/L浓度组的形态改变最为明显。模型组中的细胞在镜下可见其贴壁生长良好，细胞轮廓清晰，细胞间结构紧密，细胞生长旺盛，几乎无脱落，胞浆饱满，相邻细胞生长致密，融合成片。结果见图1。

22MTT比色法检测结果表1结果表明，亚砷酸对人肺腺癌细胞株的增殖具有显著性抑制作用，且呈一定的时间依赖性，但与其药物浓度不成正比。

23人p53基因检测结果表2结果显示，不同浓度的亚砷酸作用于LAC?48?h?后，细胞培养上清液中的p53含量与模型组比较显著性升高（均Ｐ＜００5或Ｐ＜００１）。表明各浓度的亚砷酸均能上调LAC p53基因的表达。

　　表1各浓度亚砷酸对人肺腺癌细胞的抑制作用　略

　　图1培养?72?h?后各组细胞形态比较（略）

　　表2各浓度亚砷酸对人肺腺癌细胞p53基因表达的影响　略

3讨论

本实验以AS２Ｏ３作用于人肺腺癌细胞株，采用MTT比色法检测不同浓度AS２Ｏ３对LAC细胞抑瘤率的影响，ELISA法检测其作用LAC细胞?48?h?后对人p53基因表达的影响，以进一步探讨AS２Ｏ３对肺癌细胞的作用机理。肿瘤的特性之一是细胞周期异常，使肿瘤无限制地增殖，肿瘤治疗的中心环节是干扰肿瘤细胞的细胞周期，从而使肿瘤细胞增殖速率减慢或诱导细胞走向程序性死亡［6］。而细胞增殖、分化和凋亡是细胞生命活动中相互关联、相互影响的三种基本现象。细胞正常的增殖与分化、增殖与凋亡在机体内环境稳定中起着重要作用。细胞恶变被认为是增殖和分化两者平衡失调或偶联的解除，而细胞凋亡是一种内在基因调控，是维护内环境稳定的一种细胞自主性死亡过程。故细胞分化异常、增殖过度、凋亡受抑制等是肿瘤形成的基础。抑制增殖、诱导分化、降低恶性程度，促使肿瘤细胞死亡是肿瘤治疗的目的。抑癌基因p53位于人类第17号染色体短臂17P131位置，是一个公认的细胞凋亡诱导因子［7］。野生型p53基因的主要功能是整合细胞对各种危机状况，如物理或化学因素造成DNA损伤、缺氧等的反应，再通过p53蛋白的靶基因行使各项功能，例如通过靶基因p21及GADD45，调控细胞周期的G1、G2/M转换点，以维持基因组的遗传学稳定性；通过上调靶基因bax及IGFBP3，下调bcl2基因，促进细胞的凋亡。p53基因突变在人类许多常见肿瘤中均可检测到，包括肝癌、胃癌、大肠癌、食道癌、子宫癌、肺癌等，p53基因突变是不同类型肺癌中最常见的基因改变，且出现的频率比其他肿瘤要高得多。Takahashi等［8］发现小细胞肺癌（SCLC）中p53基因突变率最高，可达80%，非小细胞肺癌（NSCLC）中p53基因突变率也可达60%。本实验研究显示，经亚砷酸处理不同时间后，与模型组比较LAC肿瘤细胞在形态学上出现了凋亡特征性形态变化；MTT检测结果显示，亚砷酸对人肺腺癌细胞株（LAC）的增殖具有显著性抑制作用，且呈一定的时间依赖性，但与其药物浓度不成正比。通过检测经亚砷酸处理?48?h?后LAC细胞上清液p53基因的含量，结果提示，亚砷酸可上调p53基因的表达。因此，亚砷酸抗肺癌的作用可能是通过上调p53基因的表达来诱导LAC肿瘤细胞凋亡，从而抑制LAC细胞的增殖，这可能也是中药砒霜治疗肿瘤的机理之一。

【参考文献】