【摘要】 
目的:采用RT-PCR法获取TIMP-4基因，并通过原核表达获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。方法:从SD大鼠心肌组织中提取总RNA，利用RT-PCR法扩增出TIMP-4基因，经基因序列分析后构建表达载体PET-28a(+)-TIMP-4，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导TIMP-4的表达。利用N2+-NTA纯化和复性后，根据其骨肉瘤细胞迁移能力的影响检测其活性。结果:克隆到编码序列完全正确的大鼠TIMP-4基因，能在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物占全菌总蛋白的23.5%，N2+-NTA纯化和复性后，纯度达90%以上。纯化后的融合蛋白使骨肉瘤细胞株的迁移能力得到显著抑制。结论:通过基因克隆和原核表达的方式可以大量获得具有生物活性的TIMP-4融合蛋白。

【关键词】  TIMP-4基因 克隆 基因表达 免疫活性

    Abstract:  Objective:To extract the gene of TIMP-4 with RT-PCR methods and obtain the bioactive rat TIMP-4 fusion protein expressed in E. Coli. Methods: Total RNA was extracted from cardiac muscle of SD rat. TIMP-4 gene was obtained and amplified with RT-PCR method. The isolated fragment was sequenced, recombined with plasmid pET-28a(+) at EcoRI and HindⅢ sites and transformed into E.coli cells. The expression of TIMP-4 was induced by IPTG. TIMP-4 protein was purified and renaturalized by N2+-NTA. The capability of inhibiting migration of osteosarcoma cell line was used as a measure to assay its viability. Results: The TIMP-4 gene of the rat, which was cloned and correctly coded, could be highly expressed in the E.coli strain. The expressed product of the TIMP-4 amounted for 23.5% of the total bacterial protein. The TIMP-4 amounted for at least 90% after N2+-NTA purification. The purified TIMP-4 protein could significantly inhibit the migration of osteosarcoma cell line. Conclusion: TIMP-4 fusion protein with bioactivity can be obtained profusely by gene cloning and expression in E. Coli.

    Key words:  TIMP-4; gene clone; expression; viability assay

    目前对恶性肿瘤的治疗尚缺乏非常有效的措施，其主要原因在于肿瘤具有侵袭、转移和基因变异等特性，对肿瘤侵袭转移机制方面的研究成为肿瘤治疗的关键。组织基质结构的破坏和肿瘤新生血管的形成是肿瘤生长、转移得以实现的先决条件。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）为一类蛋白水解酶家族，它能降解多种胶原蛋白、纤维连接蛋白和弹性蛋白等血管基膜和基质结构，为肿瘤的生长、转移创造合适的环境。金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）的发现是肿瘤研究上的一大突破，它是MMP的天然抑制剂，目前根据发现的时间顺序分别称为TIMP（1～4）。国内外对于TIMP-4的功能已经有了一些研究，但结果有所差异。Jiang等[1]的研究发现，TIMP-4可以抑制乳腺癌细胞的凋亡，而更多的实验表明TIMP-4为肿瘤生长的抑制因素[2，3]。为进一步开展对TIMP-4在骨肉瘤和软骨肉瘤方面的作用及其机制的研究，以及对其在其他领域的功能，本实验采用分子生物学的基因克隆、表达和纯化等手段，力求获取具有生物活性的TIMP-4融合蛋白，为以后的研究打下基础。

    1  资料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  组织来源：成熟SD大鼠由第二军医大学实验动物中心提供。

    1.1.2  菌种、质粒和细胞：大肠杆菌TG1、BL21(DE3)、pBluescriptSK(+)质粒、表达质粒pET-28a(+)均由第二军医大学神经生物学教研室提供。骨肉瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生化研究所。

    1.1.3  试剂：RNA抽提试剂盒为上海化舜生物工程有限公司产品。RT-PCR试剂盒为Qiagen公司产品。Pyrobest DNA聚合酶为Takara公司产品。限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶为MBI公司产品。质粒抽提和胶回收试剂盒为Viogene公司产品。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）为上海生工公司产品。Ni2+-NTA柱为Sigma公司产品。

    1.2  方法

    1.2.1  RT-PCR

    1.2.1.1  总RNA的提取：取成熟SD大鼠心肌组织约150 mg，参考萨姆布鲁克等[4]方法及RNA抽提试剂盒手册，电动匀浆后行总RNA的提取。

    1.2.1.2  cDNA的合成：参考RT-PCR试剂盒实验手册进行。RNA(1μg/μl)2.0μl，dNTPs(5mM dNTP)2.0μl，Oligo-dT引物（10 unit/μl）1.0μl，RNase抑制剂（10 unit）1.0μl，逆转录酶（4 unit）1.0μl，无RNase水加至20μl。37 ℃温育60 min，然后90 ℃温育5 min使逆转录酶失活。-20 ℃保存。

    1.2.1.3  PCR扩增：参考GeneBank(gi:48255910)发表的序列及表达载体pET-28a(+)多克隆位点、应用DNAstar软件设计引物，由上海生工公司合成。

    上游引物： 5' TGCGAATTCATGCCTGGGAGCCCT 3'

    EcoRI

    下游引物： 5' GCAAACGTTGATCATCCCTGGTCACTG 3'

    HindIII

    取逆转录产物2.0μl为模板，按常规PCR反应条件，先将样品于94 ℃变性5 min，加入2.5 u的Pyrobest DNA聚合酶，按下列参数循环35次：94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，最后一个循环后，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

    1.2.3  载体的构建及DNA序列分析：将RT-PCR产物平端与用EcoRⅤ酶切过的pBSK(+)质粒，回收后转化大肠杆菌TG1，挑白斑培养抽提质粒并进行初步酶切鉴定，选择3株酶切合格质粒送生工公司测序。把测序正确的质粒用EcoRI和HindⅢ双酶切，胶回收后与预先经EcoRI和HindⅢ双酶切的表达载体pET-28a(+)在连接酶作用下相连接，构建T7启动子控制下的TIMP-4表达质粒（见图1）。将pET-28a(+)-TIMP-4表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。

    1.2.4  重组克隆的诱导表达、纯化和复性及鉴别：将pET-28a(+)-TIMP-4表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，接种单菌落至3 ml LB培养液中37 ℃培养过夜，按2%的比例转接于LB培养液中（含50μg/ml的卡那霉素），37 ℃培养至A600条件下为0.6～1.0，加入IPTG（终浓度为1 mM/L），诱导3～5 h，离心收集菌体，进行SDS-PAGE蛋白电泳，薄层扫描检测TIMP-4的表达情况。诱导表达菌经超声破碎后，收集包涵体，用洗涤缓冲液洗涤，500 ml菌液制备的包涵体溶于20 ml溶解缓冲液。溶解后的蛋白用结合缓冲液透析24 h后进行纯化。由于TIMP-4的N端融合了6×His，所以表达产物以Ni2+-NTA树脂来纯化。溶解的蛋白上预先以3倍柱体积结合缓冲液平衡的Ni2+-NTA柱后，先以10倍结合缓冲液洗涤，再分别以10倍柱体积的NTA-PH6.5 Buffer和NTA-PH5.80 Buffer洗脱杂蛋白。

 直接在Ni2+-NTA柱上复性[5]。先用10倍柱体积的复性缓冲液A洗涤，再用15倍柱体积的复性缓冲液B洗涤。最后用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。纯化的TIMP-4经蛋白质浓度测定后，-70 ℃保存。

    Western blot分析鉴别：用10%丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳(每孔加TIMP-4纯化融合蛋白20μl)，电泳后将蛋白转移至硝酸纤维膜上，切取条带后在4 ℃条件下以的TIMP-4单克隆抗体(1:100 Sigma)孵育24 h，漂洗后以带有辣根过氧化物酶的二抗37 ℃孵育30 min，4-氯-1-萘酚（Sigma）显色。

    1.2.5  实验操作方法：质粒抽提、酶切反应、DNA片段回收、连接反应、细菌转化、SDS-PAGE电泳等实验操作均参照文献[4]略加修改进行。

    1.2.6  TIMP-4蛋白对骨肉瘤细胞侵袭性影响的测定(微孔迁移技术)：Boyden小室的构建参照Mohyeldin A等[6]方法。用DMEM制备浓度为2×105个/ml的骨肉瘤细胞悬液，分成两组：1组为对照组，另1组含浓度为20μg/ml的TIMP-4蛋白，向小室中各加入细胞悬液100μl，37 ℃孵育24 h后将小室置于4%中性甲醛中固定20 min，存在于微孔滤膜上面的细胞用棉签蘸95%乙醇轻轻擦去，侵袭至膜下的细胞用苏木精和5%结晶紫染色，膜干燥后用剪刀将膜剪开，置于玻片上中性树胶封片并计数，每张膜取上、下、左、右、中5个视野，取均数，每种处理分别重复3次。取穿过膜的细胞相对数作为衡量细胞侵袭能力的指标，计算方法为：侵袭力=（1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数）×100%。

    1.3  统计学处理方法  采用t检验进行统计检验。

    2 结果

    2.1  TIMP-4基因的获得  新生4 d SD大鼠心肌细胞组织总RNA，经甲醛变性电泳，紫外检测仪下可见完好的28 s，18 s rRNA，表明提取的总RNA质量可靠，未出现降解。RT-PCR扩增得到大小约680 bp的特异条带，大小与预测结果一致（见图2）。回收此片段平端克隆入载体pBSK(+)，转化感受态TG1，挑取重组子，经EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定，琼脂糖电泳（见图3），表明插入片段大小与预测大小一致。对重组质粒中插入片段测序，结果表明分离的TIMP-4基因序列与GeneBank(gi:48255910)发表的序列一致。

    2.2  TIMP-4的诱导表达、纯化及复性  采用IPTG诱导表达后发现，在分子量约23 kD处有显著的蛋白表达条带，该蛋白大小与理论计算值基本一致，凝胶自动扫描分析显示，其占BL21细菌总蛋白的23.5%，基本是以包涵体形式存在。将大量诱导的BL21细菌超声破碎、洗涤、溶解、纯化、复性后，经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析，除TIMP-4特异条带外，基本无其他条带，薄层扫描结果可见纯度达90%以上，详见图4、图5。经过Western blot分析后显示所取得的蛋白质与TIMP-4抗体具有特异性作用，为TIMP-4蛋白（见图6）。

    2.3  TIMP-4的活性测定  Matrigel经过重建后在聚碳酸酯膜表面形成类似天然基底膜结构，对其的侵袭能力可以显示出肿瘤细胞的侵袭力。本研究中显示，TIMP-4融合蛋白使骨肉瘤细胞侵入基底膜能力受到明显影响，浸入的细胞数为（61.3±5.2）[对照组为（80.5±7.6）]，其抑制率达到25.1%(见表1)。

    3  讨论

    TIMP-4是1996年John Greene等[7]采用已表达序列标志(expressed sequence tag，EST)序列测定的方法研究MMP的抑制物TIMP时发现的，属于TIMP家族成员中的一员，根据发现的先后顺序而被命名为TIMP-4。后来通过免疫组化、Northen-Blot，RT-PCR及原位杂交等方法来研究发现，TIMP-4的组织表达相当局限，在肾脏、胰腺、结肠及直肠中的表达量非常低，在肝脏、脑、肺、甲状腺、小肠等组织中基本无表达，但在心脏有大量的转录和翻译。鉴于此，我们选择用成熟SD大鼠的心肌细胞作为基因的组织来源，参考GeneBank(gi:48255910)发表的序列，应用DNAstar生物软件设计引物，用RT-PCR方法分离到了TIMP-4目的基因，经序列测定显示分离得到的TIMP-4目的基因与文献报道一致。这意味着在SD大鼠的心肌细胞中确实有TIMP-4 mRNA表达，并且该研究中所采用的引物设计正确且条件合适。研究中把分离到的目的基因克隆至pET-28a(+)表达载体，以大肠杆菌BL21为宿主菌进行表达，发现在BL21中TIMP-4的表达量可占全菌总蛋白的23.5%，且基本上是以包涵体的形式存在。由于TIMP-4的N端融合了6′His，所以表达产物在溶解后采用N2+-NTA柱来纯化。

    本研究中采用直接在N2+-NTA柱上进行复性，使传统的透析复性、稀释复性等方法存在的效率低、损失量大的缺点得到了很大的克服。用获得的TIMP-4蛋白加入培养基中发现，TIMP-4蛋白对骨肉瘤的侵袭力产生了较大的影响，抑制率达到25.1%，这意味着所获得的TIMP-4蛋白具有抑制骨肉瘤侵袭能力的生物学活性，从而为后续的TIMP-4的结构和功能研究提供了基础。

【参考文献】