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钙蛋白酶与阿尔茨海默病关系的研究进展

2010-04-28 19:37:17 作者：新特药房来源：互联网浏览次数：64 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 钙蛋白酶是一种胞内Ca2+依赖性的、水解半胱氨酸的蛋白酶家族[12],通过特异性蛋白水解酶作用调节多种酶和蛋白质的功能,包括信号传导分子和细胞骨架蛋白等,在细胞活动、信号传导、稳定细胞骨架结构等方 ...

关键字：阿尔茨海默病 tau蛋白质类淀粉样β蛋白细胞凋亡综述(文献类型)

钙蛋白酶是一种胞内Ca2+依赖性的、水解半胱氨酸的蛋白酶家族[12],通过特异性蛋白水解酶作用调节多种酶和蛋白质的功能,包括信号传导分子和细胞骨架蛋白等,在细胞活动、信号传导、稳定细胞骨架结构等方面发挥作用。钙蛋白酶在神经系统广泛分布,阿尔茨海默病(AD)是一种慢性进行性神经系统退行性疾病,临床特点为进行性痴呆,表现为智力、记忆力、定向力、推理和判断能力等不可逆性退化;主要病理改变为大量的β淀粉样蛋白(βamyloid protein,Aβ)沉积形成的神经炎性斑块、过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangle,NFT)以及选择性的神经元丧失。近期研究表明，钙蛋白酶功能失调可能在AD的发病过程中发挥重要作用。笔者就钙蛋白酶的结构、活性调节以及在AD的NFT和Aβ病理形成中的作用做一综述。

1钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白的结构

1.1钙蛋白酶的结构至今已证实钙蛋白酶家族成员有14个[3]。钙蛋白酶Ⅰ和钙蛋白酶Ⅱ是研究最多的2类钙蛋白酶超家族成员,它们的区别主要在于体外激活时所需Ca2+浓度不同,后者在纯化状态下,需要毫摩尔浓度Ca2+才有最佳活性,而前者在微摩尔浓度Ca2+即可有最佳活性。钙蛋白酶由1个大亚基(80 kD)和1个小亚基(30 kD)组成异二聚体。大亚基有4个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ):结构域Ⅰ位于N末端,Ca2+与酶结合后,结构域Ⅰ可发生自我水解,引起蛋白酶构象改变;结构域Ⅱ是蛋白酶活性区,有木瓜蛋白酶样的结构,由Cys105、His262、Asn286 3个氨基酸残基组成酶的活性中心;结构域Ⅲ是抑制蛋白或激活蛋白结合的部位;结构域Ⅳ是Ca2+结合的部位。小亚基有2个结构域,结构域Ⅰ富含甘氨酸和疏水氨基酸,是酶与细胞膜结合的部位;结构域Ⅱ与大亚基结构域Ⅳ结构相似,也含有Ca2+结合位点。

1.2钙蛋白酶抑制蛋白的结构钙蛋白酶抑制蛋白是一特异性内源性抑制剂蛋白,与钙蛋白酶共存,构成钙蛋白酶/钙蛋白酶抑制蛋白系统，起负性调节作用。典型的钙蛋白酶抑制蛋白分子有5个结构域,Ⅰ区为氨基末端,Ⅱ~Ⅴ区均含有同源性序列ThrIleProProXTyrArg(X代表任何一种氨基酸),是对钙蛋白酶起抑制作用的关键部位,为抑制区。

2钙蛋白酶活性的调节

钙蛋白酶以一种无活性的酶原形式存在,构成酶活性中心的氨基酸残基(cys105,his262,asn286)彼此分离,无法形成酶活性中心,蛋白酶的激活需要通过构象的改变,使残基相互接近形成酶活性中心。

2.1钙蛋白酶的激活钙蛋白酶活性受到严格调控,其中Ca2+的作用最为重要。细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)升高使钙蛋白酶大亚基结构域Ⅰ自我水解,构象改变,形成酶活性中心,表现出蛋白酶活性[45]。

钙蛋白酶在膜上的定位也是调节其活性的重要机制,早期研究认为,钙蛋白酶一旦与质膜结合,即可由非活性状态转变成活性状态,然而其他研究表明,钙蛋白酶Ⅰ与钙蛋白酶Ⅱ在自我水解前即有活性。通过与膜相互作用使钙蛋白酶在膜上被活化,钙蛋白酶即进入胞质并能抵御钙蛋白酶抑制蛋白的抑制作用。活化的钙蛋白酶可在膜上或胞质降解底物蛋白[68]。

钙蛋白酶自我水解所需的Ca2+浓度与表现酶蛋白水解活性所需要的Ca2+浓度相近却比活细胞中[Ca2+]i水平要高得多。如何启动激活钙蛋白酶？解决矛盾的办法在于发现了磷脂的存在。在磷脂酰肌醇存在情况下,激活钙蛋白酶所需的Ca2+浓度大为降低。

2.2钙蛋白酶的磷酸化调节研究表明,钙蛋白酶序列内含有许多磷酸化作用位点,钙蛋白酶Ⅰ有9个磷酸化位点,钙蛋白酶Ⅱ有8个磷酸化位点,这些磷酸化位点均位于80 kD亚基上[9],并主要集中于两个区域:结构域Ⅰ和Ⅱ结合处(Ⅱa)及结构域Ⅱ氨基末端(Ⅱb)。上皮生长因子(EGF)刺激细胞通过Erk/MAP激酶信号通路来激活钙蛋白酶[10],通过上皮生长因子信号通路激活的钙蛋白酶又可被蛋白激酶A的磷酸化作用所抑制[1112]。

2.3钙蛋白酶活化蛋白与活性的负调节1987年Pontremoli报道,isovalerylcarnitine可降低钙蛋白酶Ⅱ发挥最大催化活性所需的Ca2+浓度,同时可使其活性增加1.5倍,但不降低钙蛋白酶Ⅰ发挥最大催化活性所需的Ca2+浓度或者增加活性。此后Melloni等从小鼠的骨骼肌细胞中分离得到一也具有相似作用的热稳定多肽calpain activator。此后研究表明calpain activator是相对分子质量30 kD的二聚体,其氨基酸顺序及功能均与羊肝脏蛋白UK114一样。

钙蛋白酶抑制蛋白可识别钙蛋白酶与钙结合形成的构象变化,并与之特异结合。当钙蛋白酶被Ca2+激活后,如果附近有钙蛋白酶抑制蛋白存在,后者将与钙蛋白酶特异结合而抑制其活性,从而保证钙蛋白酶对底物只进行特定部位的水解。钙蛋白酶抑制蛋白与钙蛋白酶的结合需要Ca2+,并且这种结合是可逆的,即在无钙离子时重新分离。

3钙蛋白酶与AD

AD的病因、病理非常复杂,涉及遗传、环境,生物、物理、化学等诸因素,因而迄今为止,其发病机制仍不清楚,钙平衡紊乱是发病机制的重要假说之一[1314]。

3.1钙蛋白酶的激活促进细胞骨架的瓦解和NFT的形成在AD发病早期，与钙平衡紊乱相关的钙蛋白酶系统就已被激活,在轴突丧失、神经元退化以及tau蛋白异常磷酸化出现之前，特定区域的钙蛋白酶的活性就已升高。此外,在AD病人的脑组织中观察到活性形式的钙蛋白酶就位于NFT和神经毡丝处[15],因此在AD中钙蛋白酶早期活化很可能促成了细胞骨架的裂解和神经纤维缠结的形成。

3.1.1钙蛋白酶的激活直接参与微管相关蛋白的降解微管相关蛋白在神经元细胞骨架中通过与微管蛋白的相互作用,影响微管的聚合、稳定以及微管的动力学特性,微管相关蛋白(microtubuleassociated proteins,MAP)依据相对分子质量的大小划分为:高相对分子质量蛋白MAP1A、MAP1B、MAP2a和MAP2b,中相对分子质量蛋白MAP2c和tau。MAP2、tau都是钙蛋白酶的特异性底物。Fifre等在原代培养皮层神经元中加入Aβ证实了活化的钙蛋白酶可以降解MAP2a、MAP2b、MAP2c[15]。Fang等分别用不同浓度CaCl2溶液孵育Wistar大鼠脑皮质匀浆液,并用蛋白质印迹和定量图像分析技术检测不同亚型钙蛋白酶对tau蛋白的降解作用,发现一定浓度的Ca2+可同时激活钙蛋白酶Ⅰ和钙蛋白酶Ⅱ,这两种亚型钙蛋白酶均参与降解tau蛋白,但钙蛋白酶Ⅱ的作用比钙蛋白酶Ⅰ更强[16]。

3.1.2钙蛋白酶的激活与细胞骨架的过度磷酸化NFT是AD特征性的病变之一,其主要成分是双螺旋丝(paired helical filaments,PHF),而过度磷酸化的tau蛋白是PHF的主要亚单位,活化的钙蛋白酶可以通过调节激酶活性或者信号传导通路引起tau、NF(neurofilaments)等细胞骨架蛋白的过度磷酸化。过度磷酸化的tau蛋白无法结合微管蛋白,从而阻断微管蛋白的组装,抑制微管聚集,使微管解体及细胞骨架破坏。同时过度磷酸化的tau蛋白对钙蛋白酶的水解具有高度的拮抗能力。福建医科大学学报2007年5月第41卷第3期林智颖等：钙蛋白酶与阿尔茨海默病关系的研究进展

钙蛋白酶通过tau蛋白激酶Ⅱ(tau protein kinaseⅡ,TPKⅡ)/细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase5,CDK5)途径使tau蛋白过度磷酸化。TPKⅡ/CDK5是脯氨酸依赖性的丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,调节亚基非周期素蛋白p35是其特异的激动剂。在兴奋性刺激(如脑缺血、H2O2、兴奋性氨基酸)、Aβ、自由基、氧化应激及其他应激刺激下,经过钙蛋白酶作用,p35能在羧基末端第208位裂解成p25和另一大小为10 kD片段,p25具备激活CDK5的功能。由于p25/CDK5缺乏膜锚定信号基序,致使p25/CDK5在细胞内定位发生改变,持续性地磷酸化其适宜底物,引发病理性改变[1719]。

此外,钙蛋白酶可以通过Erk/MAPK途径使细胞骨架蛋白过度磷酸化。Veeranna发现在原代培养的海马和小脑颗粒神经元中,Ca2+内流活化了钙蛋白酶和Erk1、2并使NF磷酸化增加,抑制Erk1、2活性或特异性地抑制它上游激酶MEK1、2可明显地减少NF的磷酸化[20]。用钙蛋白酶的抑制剂calpeptin可阻断Erk1、2活化和NF的过度磷酸化,由此可以证明钙蛋白酶是Erk1、2通路的上游激动剂并很可能部分介导了NF和tau蛋白的磷酸化。

3.2钙蛋白酶与Aβ的沉积Aβ在脑内沉积形成神经炎性斑块是AD的病理特征之一。Aβ是由β淀粉样前体蛋白(βamyloid precursor protein,APP)经内源性蛋白水解产生的。β和γ分泌酶参与淀粉样酶切过程,β分泌酶首先在Aβ结构域的N端进行切割,释放出较长的可溶性APP片段(soluble APPβ,sAPPβ),而C端的片段(Cterminal fragment,CTF)仍然与膜结合,随后γ分泌酶水解CTFβ,产生了一系列长短不等的Aβ(39~43个氨基酸)和CTFγ,其中有病理意义的是Aβ40和Aβ42。另外,α分泌酶和γ分泌酶参与非淀粉样酶切过程,α分泌酶在Aβ结构域之内水解APP,阻断了完整的Aβ生成。由于αβ和γ分泌酶均与钙蛋白酶无关,故认为钙蛋白酶并未直接参与β淀粉样蛋白的生成。然而在AD病人脑组织中发现Ca2+、钙蛋白酶Ⅱ浓度均增高,由钙蛋白酶Ⅰ水解生成的76~78 kD片段也明显增多,因此也有人推测异常活性的钙蛋白酶可能通过PKC途径影响Aβ的分泌[3]。

3.3钙蛋白酶与AD神经元凋亡的调控AD中神经元的丧失与凋亡有关,钙蛋白酶可能参与神经元凋亡的调控。Ray等用H2O2及A23187诱导细胞氧化应激及Ca2+增高可使PC12细胞凋亡,而用选择性钙蛋白酶抑制剂可阻断68 kD神经纤维蛋白的降解及细胞凋亡的发生,表明钙蛋白酶参与了PC12细胞的凋亡[21]。

钙蛋白酶可能通过水解钙调磷酸酶（calcineurin,CaN）使之活化参与凋亡基因的调控。Ray等用H2O2及A23187诱导PC12细胞凋亡时,Bax mRNA的表达无显著变化,而Bc12 mRNA表达水平下降,导致Bax/Bcl2比率增高,而用细胞膜通透性选择性钙蛋白酶抑制剂MDL28170可抑制Bax/Bcl2比率增高,表明钙蛋白酶可能通过提高细胞内Bax/Bcl2表达的比率,促进细胞凋亡[21]。此外，Wang等实验表明钙调磷酸酶可以使BAD去磷酸化,去磷酸化BAD从胞质转移至线粒体,并在此与Bcl2、Bclx结合促进细胞色素C释放,从而激活caspase途径导致细胞凋亡[22]。那么由它们各自调节的凋亡通路之间是否有关联？Liu等发现AD脑中钙调磷酸酶的A亚基在lys501位置可被钙蛋白酶水解而激活[23]。Wu等在用海人藻酸(KA)和谷氨酸诱导的2种神经兴奋性模型中发现激活的钙蛋白酶可以裂解cain/cabin1(钙调磷酸酶的一种内源性抑制剂),从而激活钙调磷酸酶的活性,并引发钙调磷酸酶介导的细胞凋亡[24]。以上研究结果说明,钙蛋白酶可以通过水解钙调磷酸酶使之活化,并可能在兴奋性毒性所致的神经细胞凋亡中起关键作用。

钙蛋白酶以酶原形式存在,只有在其他调节因子作用下,改变酶自身构象才能被激活。在生理状态下,钙蛋白酶通过特异性水解修饰调节多种酶的活性,从而发挥自己在细胞活动、信号传导、稳定结构等方面的作用。但是当其功能异常时,可以导致多种疾病的发生。在AD,钙蛋白酶在细胞骨架的裂解和NFT的形成中起重要作用,并可能与神经炎性斑块的形成有关,因此针对钙蛋白酶及其调节因子的药物有望在治疗AD中发挥有效作用。

【参考文献】
\[1\]Sato K,Kawashima S.Calpain function in the modulation of signal transduction molecules\[J\]. Biol Chem, 2001,382(5):74351.

\[2\]Sorimachi H.,Suzuki K.The structure of calpain\[J\]. J Biochem, 2001,129(5):65364.

\[3\]Goll D E,Thompson V F,Li H,et al. The calpain system\[J\]. Physiol Rev, 2003,83(3):731801.

\[4\]Moldoveanu T,Hosfield C M,Lim D,et al. A Ca(2+)switch aligns the active site of calpain\[J\]. Cell, 2002,108(5):64960.

\[5\]Schoenwaelder S M,Yuan Y,Jackson S P. Calpain regulation of integrin alpha Ⅱb beta 3 signaling in human platelets\[J\]. Platelets, 2000,11(4):189198.

\[6\]Zalewska T,Thompson V F,Goll D E. Effect of phosphatidylinositol and insideout erythrocyte vesicles on autolysis of mu and mcalpain from bovine skeletal muscle\[J\]. Biochim Biophys Acta, 2004,1693(2):125133.

\[7\]Rock M T,Dix A R,Brooks W H,et al. Beta1 integrinmediated T cell adhesion and cell spreading are regulated by calpain\[J\]. Exp Cell Res, 2000,261(1):260270.

\[8\]Glading A,Uberall F,Keyse S M,et al. Membrane proximal ERK signaling is required for Mcalpain activation downstream of epidermal growth factor receptor signaling\[J\]. J Biol Chem, 2001,276(26):2334123348.

\[9\]Cong J,Thompson V F,Goll D E. Phosphorylation of the calpains\[J\]. Mol Biol Cell, 2000,11:386a.

\[10\]Glading A,Chang P,Lauffenburger D A,et al. Epidermal growth factor receptor activation of calpain is required for fibroblast motility and occurs via an ERK/MAP kinase signaling pathway\[J\]. J Biol Chem, 2000,275(4):23902398.

\[11\]Shiraha H,Glading A,Chou J,et al. Activation of mcalpain(calpain Ⅱ) by epidermal growth factor is limited by protein kinase A phosphorylation of mcalpain\[J\]. Mol Cell Biol, 2002,22(8):27162727.

\[12\]Smith S D,Jia Z,Huynh K K,et al. Glutamate substitutions at a PKA consensus site are consistent with inactivation of calpain by phosphorylation\[J\]. FEBS Lett, 2003,542(13):115118.

\[13\]LaFerla F M. Calcium dyshomeostasis and intracellular signalling in Alzheimer's disease\[J\]. Nat Rev Neurosci, 2002,3(11):862872.

\[14\]Mattson M P,Chan S L. Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer's disease\[J\]. Cell Calcium, 2003,34(45):385397.

\[15\] Fifre A,Sponne I,Koziel V,et al. Microtubuleassociated protein MAP1A,MAP1B,and MAP2 proteolysis during soluble amyloid betapeptideinduced neuronal apoptosis\[J\]. J Biol Chem, 2006,281(1):229240.

\[16\]Fang Z Y,Liu S J,Wang X C,et al. Effect of calpain on the degradation of tau in rat brain cortex extracts\[J\]. Prog Biochem Biophys, 2003,30(6):884888.

\[17\]Kusakawa G,Saito T,Onuki R,et al. Calpaindependent proteolytic cleavage of the p35 cyclindependent kinase 5 activator to p25\[J\]. J Biol Chem, 2000,275(22):1716617172.

\[18\]Jamsa A,Backstrom A,Gustafsson E,et al. Glutamate treatment and p25 transfection increase Cdk5 mediated tau phosphorylation in SHSY5Y cells\[J\]. Biochem Biophys Res Commun, 2006,345(1):324331.

\[19\]Patzke H,Tsai L H. Calpainmediated cleavage of the cyclindependent kinase5 activator p39 to p29\[J\]. J Biol Chem, 2002,277(10):80548060.

\[20\]Veeranna, Kaji T,Boland B, et al. Calpain mediates calciuminduced activation of the erk1,2 MAPK pathway and cytoskeletal phosphorylation in neurons:relevance to Alzheimer's disease\[J\]. Am J Pathol, 2004,165(3):795805.

\[21\]Ray S K,Fidan M,Nowak M W,et al. Oxidative Stress and Ca2+ influx upregulate calpain and induce apoptosis in PC12 cells\[J\]. Brain Res, 2000,852(2):326334.

\[22\]Wang H G,Pathan N,Ethell I M,et al. Ca2+induced apoptosis through calcineurin dephosphorylation of BAD\[J\]. Science, 1999,284(5412):339343.

\[23\]Liu F,GrundkeIqbal I,Iqbal K,et al. Truncation and activation of calcineurin A by calpain I in Alzheimer disease brain\[J\]. J Biol Chem, 2005,280(45):3775537762.

\[24\]Wu H Y,Tomizawa K,Oda Y,et al. Critical role of calpainmediated cleavage of calcineurin in excitotoxic neurodegeneration\[J\]. J Biol Chem, 2004,279(6):49294940.