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抑癌基因fhit及凋亡抑制蛋白survivin在宫颈鳞状细胞癌的表达及意义

2010-04-28 19:56:50 作者：新特药房来源：互联网浏览次数：41 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 摘要: 目的探讨抑癌基因fhit和凋亡抑制蛋白survivin在宫颈鳞状细胞癌（鳞癌）及宫颈上皮内瘤变（CIN）的表达与意义及其相关性。方法采用免疫组织化学技术（SP法）检测82例宫颈鳞癌和40例CIN以及 ...

关键字：宫颈肿瘤；癌鳞状细胞；基因肿瘤抑制；微管相关蛋白质类；组氨酸；免疫组织化学

摘要:
目的探讨抑癌基因fhit和凋亡抑制蛋白survivin在宫颈鳞状细胞癌（鳞癌）及宫颈上皮内瘤变（CIN）的表达与意义及其相关性。
方法采用免疫组织化学技术（SP法）检测82例宫颈鳞癌和40例CIN以及20例慢性宫颈炎中fhit蛋白和survivin蛋白的表达，并结合临床病理特征进行分析。
结果
（1）fhit基因在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率为32%，与慢性宫颈炎及CIN的差别有统计学意义（P<0.01），与宫颈鳞癌的病理分级（G1～3）、临床分期（Ⅰ～Ⅲ）、患者年龄和有无淋巴转移无关（P>0.05）。
（2）survivin蛋白在宫颈鳞癌组织中的阳性表达率为69.51%，与慢性宫颈炎及CIN的差别有统计学意义（P<0.01），并随宫颈鳞癌的临床分期（Ⅰ～Ⅲ）递增（P<0.05），而且与患者年龄、有无淋巴转移有关（P<0.05），与病理分级无关（P>0.05）。
（3）fhit基因的失活和survivin蛋白的诱导在宫颈癌组织中的表达呈低度相关（P<0.05）。结论 fhit基因的失活和survivin蛋白的诱导在宫颈鳞癌的发生发展中起重要作用，可能为宫颈鳞癌的诊疗提供新的靶点。

脆性组氨酸三联体基因（fragile histidine triad，fhit）是1996年发现的一个新的抑癌基因，成为肿瘤发生及肿瘤特异性基因研究的热点[1]。survivin基因是近年来发现的一个调节细胞程序性死亡（即凋亡）的蛋白质家族IAPS（inhibitor of apoptosis proteins）8个成员中的一个，是至今发现作用最强的凋亡抑制蛋白之一[2]。两种基因均与肿瘤的发生、发展和预后相关。

子宫颈鳞状细胞癌（宫颈鳞癌）是子宫颈癌组织分类中最常见的一种，占95%左右。近年来，其发病率呈快速增长趋势。虽然，外科手术技巧的提高、放疗及免疫治疗技术的进步使子宫颈癌患者的总体生存率得到了很大的提高，但术后复发及转移、早期诊断困难等影响总体生存率的主要问题仍然突出。研究表明，fhit基因及survivin基因分别异常表达于人类恶性肿瘤如头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌和胃癌等鳞状癌细胞株中。笔者采用免疫组织化学（SP法）检测fhit、survivin在宫颈鳞癌中的表达情况，探讨它们与宫颈鳞癌发生、发展及病理分期、组织学分级的关系及相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料收集福建医科大学附属第二医院20012004年原发性宫颈鳞癌手术切除标本82例，宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）40例，慢性宫颈炎20例。入选患者术前未接受化疗、放疗及免疫治疗，均具有完整的临床与病理数据。

　　1.2 分组（1）宫颈鳞癌组：82例宫颈鳞癌患者，中位年龄48.14岁（26～68岁），其中>45岁40例，≤45岁42例。所有病例均经病理诊断复检核实。按1995年国际妇产联盟（FIGO）分类标准划分为：①临床分期：Ⅰ期组50例，Ⅱ期组18例，Ⅲ期组14例；②病理分级：G1组19例，G2组37例，G3组26例；③淋巴结转移：转移组（N1）26例，无转移组（N0）56例。（2）40例CIN患者分3组：Ⅰ、Ⅱ级组各15例，Ⅲ级组10例。（3）选取20例经病理检查确认为慢性宫颈炎的组织作为对照。

　　1.3 试剂浓缩型兔抗人fhit多克隆抗体（ZA0410）、浓缩型兔抗人survivin多克隆抗体（RAB0536）为美国Santa Cruz公司产品，购自北京中山生物技术有限公司；SP免疫组织化学超敏染色试剂盒和DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司。

　　1.4 实验方法采用SP法检测标本中fhit和survivin的表达情况，具体步骤按SP试剂盒说明书进行。

　　1.5 结果判断 fhit、survivin染色阳性表达判定标准：每张切片随机选择具有代表性的10个400倍视野进行观察计数，每个视野计数100个肿瘤细胞。fhit参照文献[3]，survivin参照文献[4]，均采用半定量积分法，对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度分别进行分级记分，然后根据两项之积定其阳性强度。fhit阳性以细胞质呈现棕黄色颗料状染色为主。染色强度：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分；阳性细胞百分比：阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度与阳性细胞百分比的乘积1～2分为阴性，≥3分为阳性。survivin阳性以细胞核或细胞质呈现棕黄色颗料状染色为标准。计算阳性细胞百分率：A 0～25%；B 26%～50%；C 51%～75%；D>75%。肿瘤显色深浅按：（a）阳性细胞呈淡黄色云雾状为1分；（b）阳性细胞呈黄色颗粒状为2分；（c）阳性细胞呈深黄色为3分。计算两者乘积，以得分≤1分为阴性，>1分为阳性。

　　1.6 统计学处理数据采用SPSS 11.5统计软件包进行分析。fhit与survivin表达宫颈鳞癌临床病理学指标的相关性分析采用ChiSquare检验，指标间相关分析采用Kappa法一致性检验。P<0.05表示差别有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 fhit在慢性宫颈炎、CIN和宫颈鳞癌的表达正常宫颈鳞状上皮、宫颈内膜腺上皮及肿瘤间质细胞、淋巴细胞、中性粒细胞及浆细胞等均呈中强着色，细胞核未见表达。82例宫颈鳞癌中，26例阳性表达，阳性率31.71%；20例慢性宫颈炎组织中，17例阳性表达，阳性率85%；40例CIN患者中，30例阳性表达，阳性率80%。fhit在宫颈鳞癌的表达明显低于慢性宫颈炎组和CIN组，差别有统计学意义（P<0.05)；后两者比较差别无统计学意义（P>0.05）。

　　2.2 survivin在慢性宫颈炎、CIN和宫颈鳞癌的表达 survivin基因表达阳性染色部位主要在肿瘤细胞核中，表现为粗细不一的棕黄色颗粒，也有的呈弥漫性细胞质染色（图1）。82例宫颈鳞癌中，57例阳性表达，阳性率69.51%；20例慢性宫颈炎组织中，3例阳性表达，阳性率15%；40例CIN中，12例阳性表达，阳性率30%。survivin在宫颈鳞癌中的表达明显高于在慢性宫颈炎和CIN中的表达，差别有统计学意义（P<0.05)。

　　2.3 fhit与survivin的表达和宫颈鳞癌临床病理学指标的关系见表1。

　　2.4 宫颈鳞癌组织fhit、survivin表达的相关性 fhit基因表达阳性及阴性者中survivin蛋白阳性表达率分别为7.69 %，98.21%，两者比较，差别有统计学意义（χ2=68.654，P<0.01)，即癌组织中fhit基因的失活与survivin表达上调显著相关。对82例宫颈鳞癌组织中fhit及survivin蛋白表达强度评分进行等级相关分析，fhit蛋白的阴性水平与survivin的阳性表达水平呈低度相关（Kappa=0.496，P<0.05)。

　　A:细胞质阳性表达，呈棕黄色颗粒状；B:细胞核阳性表达，呈棕黄色颗粒状.

　　图1 fhit及survivin在宫颈鳞癌组织中的表达（SP染色 ×400）（略）

　　Fig 1 Express of fhit and survivin in cervical carcinomas

　　表1 fhit与survivin表达和宫颈鳞癌临床病理学指标的关系（略）

　　Tab 1 Relationship between expression of fhit and survivin and clinical and pathological features in patients with cervical carcinoma

　　表中数据为例数（%）. fhit：脆性组氨酸三联体； survivin：凋亡抑制蛋白. 组内比较，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01.

　　3 讨论

　　3.1 fhit在宫颈鳞癌中的表达 fhit基因定位于宫颈鳞癌等位基因缺失高发区3P14.2内，被认为与人类多种恶性肿瘤的发生关系密切。它所编码的蛋白是fhit蛋白，在人体所有正常组织中均有表达，在体内的具体功能还不十分清楚。已知fhit蛋白是一种典型的腺苷三磷水解酶（dinucleoside 5’5”P1,P3triphosphate hydrolase AP3A)[5]。AP3A是ATP类似物，能抑制蛋白激酶的活性，其水平升高可增强生长信号传导途径，阻断抑制途径或凋亡通道，导致肿瘤的产生，而fhit蛋白能作用于mRNA帽类似物，影响重要基因mRNA的翻译，脱帽功能的丧失也可能引起肿瘤。

　　研究表明，fhit蛋白的C末端部分与酵母泛素结合酶9相互作用，参与S期及M期细胞周期蛋白的降解，进一步调控细胞周期[6]。Ishii等将fhit基因导入7个食管癌细胞系（其中的5个不表达内源性fhit蛋白），结果有2个细胞系发生了明显的凋亡（TE4和TE14），同样，在低水平表达内源性fhit蛋白的Hela细胞系中也有类似的现象[7]。Hendricks采用RTPCR技术对8个宫颈鳞癌细胞系进行了研究，发现63%的细胞系可检测到异常fhit转录产物，这与食管癌、乳腺癌和肺癌等肿瘤观察到的改变类似[8]。Greenspan等亦发现6/7宫颈鳞癌细胞系和68%原发性宫颈鳞癌检测不到fhit转录产物或检测到异常产物，而相应在正常宫颈上皮则表现为fhit的强表达[9]。

　　笔者实验结果显示，fhit蛋白在宫颈鳞癌中的阳性表达率为32%，明显低于慢性宫颈炎组织（85%）（P<0.05）；其阴性表达率为68.2%，介于Greenspan等报道的76%与Birrer等报道61%之间[910]，提示fhit基因表达下降，对宫颈鳞癌的发生起了重要作用。同时还发现随着肿瘤分化程度的降低、临床分期的进展变化，fhit蛋白的表达水平差别无显著性。实验结果还显示，宫颈鳞癌中fhit的表达与患者的年龄及有无淋巴结转移无关（P>0.05），支持Nakagawa等关于fhit异常表达并非宫颈鳞癌进展结果的推论[11]。
　3.2 survivin在宫颈鳞癌中的表达 survivin是一个新克隆的凋亡抑制基因，是IAP家族的一个新成员。IAP家族一般含有2~3个棒状病毒重复结构（buculovirus IAP repeat BIR）和羧基末端锌指结构，其中主要是BIR结构发挥抗凋亡作用，而survivin只含有一个BIR结构，羧基末端缺乏锌指结构，代以交织螺旋结构。其选择性表达常见于恶性肿瘤，而在癌旁正常组织和成人终末分化组织几乎不表达[12]。研究表明，survivin的抗凋亡作用主要是通过抑制Caspase3和Caspase7的活性实现的[13]。此外，survivin还可诱导癌基因cyclinD1和cmyc蛋白的表达，使细胞始终处于旺盛分裂状态并促进细胞恶性转化。以上结果表明，宫颈鳞癌细胞中survivin蛋白过度再表达，可能通过抑制肿瘤细胞凋亡，促使肿瘤细胞克服G2/M期调控点完成异常的有丝分裂，恶性转化细胞，并最终促进宫颈鳞癌形成。

　　Saitoh等用Northern bloting方法研究survivin在宫颈组织中的表达，发现在大多数标本中，survivin mRNA的表达水平在宫颈鳞癌中是正常宫颈组织的2倍[14]。研究表明，survivin的表达与宫颈鳞癌的发展密切相关，survivin在宫颈鳞癌组织中表达上调，本实验结果支持这一结论。而survivin在CIN组中的表达率与宫颈鳞癌中的表达率差别有统计学意义，说明survivin的表达可能出现于宫颈鳞癌恶性转化的早期。这在几种癌前病变如结肠息肉、乳腺瘤和皮肤原位癌中已得到证实[15]。但是什么因素导致survivin基因在肿瘤中的活化仍不清楚。

　　本实验结果显示，survivin在宫颈鳞癌的不同临床分期和有无淋巴结转移的表达有差异，即临床分期早则表达率低，而临床分期晚则表达率高；有淋巴转移者表达率高，无淋巴转移者表达率低。因此，survivin表达程度与病期进展和淋巴转移相一致，可作为预后不良的标志之一。此外，从本实验结果可以看出，survivin的表达与年龄有明显的关系，即年龄>45岁的表达率低，≤45岁表达率高（P<0.05），而与宫颈鳞癌的分化程度无关（P>0.05）。

　　3.3 fhit和survivin在宫颈鳞癌中表达的相关性宫颈鳞癌的发生如同其他的恶性肿瘤一样，是多因素损伤的复杂过程。分子遗传学研究发现，宫颈鳞癌细胞在3号染色体短臂尤其是3P1321.1区域有着高频率等位基因缺失，因此，fhit基因一经克隆定位，便引起人们对它与宫颈鳞癌关系的兴趣。fhit基因起始编码外显子E5与着丝粒侧发现了高危型HPV整合点，而HPV是已经明确的宫颈鳞癌的致病因素之一。由此可见，宫颈鳞癌中fhit蛋白表达的检测对探讨宫颈鳞癌的发病机制、早期诊断有明确的意义。凋亡抑制蛋白（IAP）是细胞内固有的、在进化上极具保守性的一组蛋白质，具有抑制凋亡的作用。CIAP和CIAP2是IAP家族的两个重要成员，可直接抑制Caspase3和Caspase7，并抑制细胞凋亡。越来越多的证据表明，survivin参与细胞分裂的调控。体外研究发现，fhit蛋白可通过Caspase通路诱导细胞凋亡。最近研究发现，XIAP和CIAP2还具有泛素蛋白质连接酶活性，能促进Caspase3通过泛素结合酶体降解。fhit基因的失活和survivin蛋白的诱导可能通过Caspase通路共同起作用。另外，survivin的降解受到泛素蛋白酶体通路的调控，而fhit蛋白能通过与泛素结合酶9类似的蛋白参与细胞周期调控。笔者实验结果发现，fhit蛋白的阴性水平和survivin的阳性表达水平呈低度相关（Kappa=0.496，P<0.05），支持上述观点。

　　笔者认为，fhit基因在宫颈鳞癌的显著低表达和survivin基因在宫颈鳞癌组织中表达上调，均可能是通过抑制宫颈鳞癌细胞的凋亡与调节细胞周期，促进细胞增殖，参与了宫颈鳞癌的发生、发展过程。fhit基因的失活和survivin蛋白的诱导在宫颈鳞癌中的发生率高达67%（55/82），可作为早期诊断宫颈鳞癌的指标之一。fhit基因可能有望成为判断CIN转归预后的指标，而survivin基因有可能成为宫颈鳞癌转移及预后的指标和基因治疗的新靶点。

　　参考文献：

　　[1] Ohta M,Inoue H,Cotticelli M G, et al. The FHIT gene spanning the chromosome 3P14.2 fragile site and renal carcinomaassociated t(3;8). breakpoint is abnormal in digestive tract cancers[J]. Cell, 1996,84:587597.

　　[2] Holcik M. The IAP proteins[J]. Trends Genitics, 2002,18(10):537538.
　　
　　[3] Hao X P,Willis J E,Pretlow T G, et al. Loss of fragile histidine triad expression in coloreectal carcinomas and premalignant lesions[J]. Cancer Res, 2000,60(1):1821.

　　[4] Sinicrope F A,Ruan S B,Cleray K Y,et al. bcl2 and p53 oncoprotein expression during colorectal tumorigenesis[J]. Cancer Res, 1995,55:237241.

　　[5] Barnes L D,Garrison P N,Siprashvili E, et al. Fhit a putative tumor suppressor in humans, is a dinuclevosicle 5'5''p1.p3triphosphate hydrolase[J]. Biochemistry, 1996,35(136):1152911535.

　　[6] Hi Y,Eon M,Farid N R, et al. Association of FHIT, a candidate tumor suppressor gene with the ubiquitinconjugating enzyme hUBCQ[J]. Biochem J, 2000,352:443448.

　　[7] Ishii H,Dumon K,Vecchione A, et al. Effect of adenoviral transduction of the fragile histidine triad gene into esophageal cancer cells[J]. Cancer Res, 2001,61:15781584.

　　[8] Hendricks D T,Taylor R,Reed M, et al. FHI gene expression in human ovarian endometrial and cervical cancer cell lines[J]. Cancer Res, 1997,57:21122115.

　　[9] Greenspan D L,Connolly D C,Wu R, et al. Loss of FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors[J]. Cancer Res, 1997,57:46924698.

　　[10] Birrer M J,Hendricks D,Farley J, et al. Abnormal Fhit expression in malignant and premalignant lesions of the cervix[J]. Cancer Res, 1999,59:52705274.

　　[11] Nakagawa S,Yoshikawa H,Kimura M, et al. A possible involvement of aberrant expression of the FHIT gene in the carcinogenesis of squamous cell carcinoma of the uterine cervix[J]. Br J Cancer, 1999,79:589594.

　　[12] Bao R,Connolly D L,Murphy M, et al. Activation of cancerspecific gene expression by the survivin promoter[J]. J Natal Cancer Inst, 2002,94(7):522528.

　　[13] Hay B A. Understanding IAP function and regulation:a view from Drosophila[J]. Cell Death Differ, 2000,7(11):10451056.

　　[14] Saith Y,Yaginuma Y,Ishikawa M, et al. Analysis of Bcl2, Bax surviving genes in uterine cancer[J]. Int J Oncol, 1999,15(1):137141.

　　[15] Grossman D,McNiff,Li F, et al. Expression of the apotosis inhibitor survivin in nonmelanoma skin cancer and gene targeting in a keratinocyte cell line[J]. Lab Invest, 1999,79:11211126.