|
以铂类为主的联合化疗延长了卵巢癌患者的生存时间，但5年生存率无明显改善。主要原因之一是随着化疗疗程的增加，癌细胞对多种化疗药物产生了耐药性。目前，临床上客观反映化疗对卵巢癌治疗效果的指标尚不多见。我们检测了36例卵巢癌患者的癌组织及腹水癌细胞(ACC)在化疗前后多药耐药基因(MDR1)表达产物P170及凋亡因子Fas(CD95，Apo-1)，探讨其临床意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料 患者组：卵巢癌36例系1997年12月至1998年6月手术及化疗患者，其中15例术后化疗期间复发。取样：于手术前或化疗前抽取静脉血2ml(抗凝)，经腹壁穿刺抽腹水50ml；术中取癌组织10g，随后分别在术后4个月(化疗3个疗程)、7个月(化疗5个疗程)和14个月(化疗10个疗程)抽腹水。化疗药物以顺铂为主，联合应用5-FU、环磷酰胺和阿霉素等。
对照组：取健康妇女外周血淋巴细胞(PBL)30例、手术切除的非赘生性卵巢组织20例。
1.2 研究方法
1.2.1 特殊试剂 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人P170及CD95单克隆抗体，免疫阴性对照抗体羊抗鼠IgG1，分别由法国国际免疫公司及北京岳泰科技公司提供。淋巴细胞分离液为中国科学院血液研究所产。
1.2.2 卵巢癌及正常卵巢组织制备成单细胞悬液 制备步骤见文献［1］。
1.2.3 PBL和ACC的提取 参照文献［2］。
1.2.4 免疫标记及检测 用PBS将各细胞悬液漂洗1次，1500r/min离心5min，调细胞数为106/ml，将各细胞悬液置入3支5ml试管，分别加入P170-FITC、CD95-FITC及羊抗鼠IgG1-FITC工作液20μl，室温避光30min，1500r/min离心5min后弃上清液，以PBS漂洗2次，最后加入PBS 500μl，上FACScan型流式细胞仪(美国BD公司产)检测。以含有P170及CD95抗原细胞的百分率表示P170及CD95含量(表达值)［2］。
1.2.5 卵巢癌细胞MDR1表达阳性的判断方法 取正常卵巢细胞P170含量95%可信区间的上限值，如检测值大于该值，为MDR1阳性；如检测值小于、等于该值，为MDR1表达阴性。
1.3 统计学处理 采用χ2检验
2 结 果
2.1 健康妇女PBL及正常卵巢组织细胞P170及CD95表达值 见表1。
表1 健康妇女PBL及正常卵巢细胞P170及CD95表达值(%，±s)
| 样 品 |
n |
P170 |
CD95 |
| PBL |
30 |
1.62±0.36 |
0.40±0.13 |
| 正常卵巢细胞 |
20 |
1.81±0.44 |
0.57±0.1 |
两种细胞标本相同指标检测值，差异无显著性(P>0.05)。根据其含量计算，PBL MDR1表达的阳性标准值为2.34%，卵巢组织MDR1表达的阳性标准值为2.69%。
2.2 患者组MDR1及Fas表达
2.2.1 初发卵巢癌组织P170及CD95检测值 分别为2.78%±0.91%和1.85%±0.60%，其中8例癌组织MDR1表达阳性，占22.2%(8/36)。
2.2.2 初发组及复发组患者化疗前ACC及PBL P170及CD95表达值 见表2。
表2 初发及复发患者化疗前ACC及PBL P170及CD95表达(%，±s)
| 组 别 |
n |
(ACC)/(P170 CD95) |
(PBL)/(P170 CD95) |
| 初发组 |
36 |
2.00±0.87 |
0.85±0.60 |
2.04±0.60 |
0.45±0.10 |
| 复发组 |
15 |
3.07±0.64? |
1.36±0.57 |
2.54±0.66 |
1.31±0.75? |
*P<0.05 vs初发组
复发组中ACC MDR1表达阳性者8例，占53.3%，显著高于卵巢癌初发时22.2%的阳性率(P<0.05)；PBL MDR1表达阳性者6例，占40.0%。复发组ACC P170含量显著高于初发组(P<0.05)，PBL CD95表达亦显著高于初发组(P<0.05)。
2.2.3 复发组患者化疗期间ACC及PBL P170及CD95表达的动态观察 见表3。由表3可见，PBL及ACC的MDR1表达呈正相关。
表3 15例复发组患者化疗不同时期ACC及PBL P170及CD95表达值(%，±s)
| 组 别 |
(PBL)/(P170含量 P170阳性率 CD95) |
(ACC)/(P170含量 P170阳性率 CD95) |
| 化疗前 |
2.54±0.66 |
40.0 |
1.33±0.75 |
3.07±0.64 |
53.3 |
1.36±0.57 |
| 化疗期间 |
| 3疗程 |
2.64±0.69 |
40.0 |
2.31±0.76* |
3.64±0.87* |
53.3 |
7.14±3.13** |
| 5疗程 |
5.76±1.24* |
66.7 |
2.44±1.02* |
7.76±2.44* |
73.3 |
6.32±3.30* |
| 10疗程 |
9.36±3.26* |
73.3 |
3.37±1.54* |
16.26±6.77** |
86.7 |
3.04±2.48* |
*P<0.05 ??P<0.01 vs化疗前
3 讨 论
肿瘤细胞的多药耐药性常降低化疗疗效，多药抗性肿瘤细胞明显的生化特征是MDR1过度表达了细胞膜表面糖蛋白(P170或P-gp)。P170是ATP依赖性药物泵，作用是加快化疗药物从细胞内排出，是肿瘤细胞自身保护的重要机制之一［3］。在PBL，P170也可出现在自然杀伤细胞(NK)、细胞毒、抑制T细胞(CD8)、B淋巴细胞及少数辅助诱导T细胞(CD4)等细胞膜上。在药物的长期作用下，这些细胞的MDR1可增加P170的表达［4］，借此保护了机体的免疫功能。因此，研究化疗过程中PBL MDR1的表达与肿瘤细胞MDR1表达的相关性有重要的临床实用价值。
细胞表面分子CD95(Fas或Apo-1)属肿瘤坏死因子家族，可反映细胞凋亡情况［5］。实验证实，多种抗癌药物使癌细胞消退是通过细胞凋亡机制［6］。
我们通过对卵巢癌组织及ACC和PBL化疗前后MDR1表达产物P170及凋亡因子CD95的流式细胞定量研究，提示(1)卵巢癌患者中约22.2%为原发性MDR1表达阳性，复发组患者中ACC MDR1阳性率则上升为53.5%，显著高于初发时的MDR1阳性率，说明MDR1阳性的卵巢癌术后更容易复发。这可能与其对化疗不敏感有关；(2)检测15例复发卵巢癌患者化疗不同时期PBL及ACC MDR1、CD95表达情况表明，随着化疗疗程次数的增加，PBL及ACC MDR1表达均呈上升趋势，有显著的相关性。提示在例行化疗过程中，可以通过检查PBL MDR1的表达程度，间接了解体内残余癌细胞对化疗的耐受性，为合理应用耐药调变剂提供客观依据。化疗后ACC凋亡因子CD95表达显著高于化疗前(P<0.01)，但随化疗的增加，CD95表达反而下降，表明癌细胞抗药性增强和化疗效果正在降低。
我们应用流式细胞免疫技术，从分子生物学水平探讨卵巢癌化疗疗效的检测，方法简便、快捷，不失为卵巢癌临床治疗研究的一个新途径。
陈保德（梁山县人民医院 272600）
尹格平（济南军区总医院）
参考文献
1，尹格平,陈涌芬,孙晓明,等.卵巢癌组织及外周血淋巴细胞多药耐药基因表达蛋白的定量研究.中华妇产科杂志,1998,33(5)：287
2，孙晓明,尹格平.实体瘤组织细胞粘附分子流式细胞研究方法的建立.中华医学检验杂志,1997,20(1)：9
3，Nooter K,Herweijer H.Multidrug resistance(MDR)genes in human cancer.Br J Cancer,1991,63:661
4，Chaudary PM,Mechetner EB,Roninson IB.Expression and activity of the multidrug resistance p-glycoprotein in human perpheral blood lymphocytes.Blood,1992,80:2735
5，Nagata S,Golstein P.The fas Death Factor.Science,1995,267(10):1449
6，Ormerod MG,Neill CF,Robertion D,et al.Cisplatin induces apoptosis in human ovarian carcinoma cell line without concomitant internucleosomal degradation of DNA.Exper Cell Res,1994,2:23 | 
