【摘要】目的：观察吡柔比星(pirarubicin，THP)对结肠癌细胞株SW-260凋亡的影响。方法：将THP加入SW-260细胞培养液，Hoechst 33258荧光染色、透射电镜观察SW-260细胞形态学变化；DNA抽提琼脂糖电泳观察DNA的“梯状”条带；并测定细胞DNA断裂百分率，以探讨THP能否引起人结肠癌细胞株SW-260发生凋亡。结果：不同浓度THP(5,10,15μmol/L)作用于SW-260细胞24小时及10μmol/LTHP作用于SW-260细胞不同时间(12,24,48小时)后，Hoechst 33258染色荧光显微镜观察及透射电镜观察均可见细胞出现典型凋亡形态学改变；DNA抽提琼脂糖电泳出现凋亡细胞特征性生化变化-DNA“梯状”条带；DNA断裂百分率则随着THP浓度的增大或作用时间延长而逐渐增高。结论：THP能诱导体外培养的结肠癌细胞株SW-260发生凋亡。

　　中图分类号：R735.35　　文献标识码：A　　文章编号：1000-467X（1999）06－0664－04

Induction of apoptosis in human colorectalcarcinoma

　　cell line SW-260 by THP

PENG Xu-yang, HE Zhi-ding, WU Yang

　　Hunan Province Tumor Hospital, Changsha 410006，P.R.China

　　【Abstract】 Objective：To investigate whether pirarubicin (THP) induce apoptosis in SW-260, a colorectal carcinoma cell line.Methods：The effect of THP on apoptosis induction of SW-260 cells line was confirmed on the basis of morphology, ultrastructure and agarose gel electrophoresis of DNA,and percentage of DNA fragmentation.Results：THP induced SW-260 cell apoptosis. When treated with different concentrations of THP (5～15 mol/L) for different time (24～48 h), SW-260 cells showed typical apoptosis features. The increase of the concentration of THP to 15 μ m/L resulted in necrosis of SW-260 cells.Conclusion：THP could inhibit SW-260 development and induce apoptosis in a concentration-and time-dependent manner.

　　Key words：Apoptosis; SW-260 cells; Pirarubicin (TH)

　　凋亡是细胞生理死亡的主要方式，在机体生长，发育及维持自身稳定中起重要作用。越来越多的资料表明：细胞凋亡与肿瘤有着密切关系，肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病〔1〕。抗癌治疗的疗效与肿瘤细胞内部细胞凋亡的反应能力有关〔2，3〕，细胞周期阻滞药和DNA复制阻滞药均可诱发肿瘤细胞发生显著凋亡〔1〕,吡柔比星(Pirarubicin，THP)系蒽环类抗生素，既是一种细胞周期（G2期）阻滞药，又是DNA复制阻滞药。我们用荧光显微照相和透射电镜及DNA电泳观察适当浓度和作用时间的THP对SW-260细胞产生凋亡，并计算其DNA断裂百分率。

　　1材料和方法

　　1.1试剂

　　DMEM培养基，Gibco产品；无支原体小牛血清，杭州四季青生物工程公司产品；琼脂糖、Hoechst 33258，Sigma产品；蛋白酶K、RNA酶，生命技术公司产品；THP,深圳万乐药业有限公司产品。

　　1.2细胞株和药物处理

　　人结肠癌细胞株SW-260细胞由湖南医科大学细胞培养室提供。在5％CO2，37℃的条件下生长于含有10％的小牛血清的DMEM培养基中，每次实验均在呈指数生长的细胞中进行，实验中的细胞密度为5×105/ml。THP溶于无菌生理盐水配成贮存液，-20℃贮存备用。细胞与各种浓度的THP作用12～48小时，每次实验设立对照组。收集细胞，观察细胞凋亡情况。

　　1.3凋亡细胞的检测方法

　　1.3.1细胞形态学观察：Hoechst 33258染色荧光显微镜观察：常规细胞涂片、固定，Hoechst 33258染色后封片，荧光显微镜下，正常细胞核呈弥散均匀荧光，凋亡细胞则表现为浓染致密的颗粒块状荧光。观察后进行显微照相；透射电镜观察：将需观察的细胞常规制备电镜超薄切片标本，进行透射电镜观察，镜下凋亡细胞的染色质固缩，聚集于核膜，并碎裂，但包膜完整，细胞器正常，还可出现凋亡小体。

　　1.3.2DNA抽提琼脂糖电泳：收集细胞并计数后，适量PBS重悬成细胞悬液，加等量低张细胞裂解液(20mmol/L Tris-HCl,pH7.5,2mmol/L EDTA,0.5％Triton X-100)，充分混匀致细胞膜破裂，离心(13000g×5min)，取上清，采用Sellin等的方法〔4〕抽提上清DNA，以来自5×105个细胞的DNA量/每孔的上样量进行1％琼脂糖电泳，观察是否出现DNA“梯形”条带。

　　1.3.3细胞DNA断裂百分率的测定：收集细胞，适量PBS重悬成细胞悬液，加等量低张细胞裂解液(20mmol/L Tris-HCl,pH7.5,2mmol/L EDTA,0.5％Triton X-100)，充分混匀致细胞膜破裂，离心(13000g×10min)，分离上清和沉淀，采用Burton的方法〔5〕（二苯胺法）分别测定上清液及沉淀物中DNA的含量，计算细胞DNA断裂百分率。

1.4统计学方法

　　数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间比较用q检验，以P＜0.05判断有无统计学意义。

　　2结果

　　2.1形态学变化Hoechst 33258染色，荧光显微镜观察，对照组SW-260细胞呈均匀荧光染色，而THP处理细胞则可见凋亡细胞，即细胞核或细胞浆内出现致密浓染颗粒块状荧光（图1）。透射电镜也观察到典型形态的凋亡细胞，染色质固缩，聚集于核膜呈境界分明的块状或月形小体，细胞浆浓缩或裂解成质膜包绕的碎片（凋亡小体），而细胞器结构基本完好（图2）。

图1　THP作用SW-260细胞Hoechst 33258染色：可见许多凋亡细胞,即细胞核或胞浆内出现致密块状荧光。对照组SW-260Hoechst 33258染色：核呈均匀荧光染色。（放大倍数40×10）

图2　THP作用SW-260细胞后透射电镜观察：（见图中箭头）呈现典型的凋亡细胞形态学变化，染色质固缩，聚集于核膜中呈境界分明的块状或月形小体，细胞浆浓缩，或裂解成质膜包绕的染色质碎片（凋亡小体）。(放大倍数5000)

　　2.2生化改变SW-260细胞经THP处理后抽提DNA，琼脂糖凝胶电泳，均见有“梯状”条带，且随着THP浓度的增大，或处理时间的延长，“梯状”条带益加明显（图3）。

图3　SW-260细胞经不同浓度THP损伤后及THP作用不同时间后DNA琼脂糖凝胶电泳图。M：标准分子量（Lambda DNA/Eco RI＋Hind Ⅲ）；A：对照组；B,C,D：THP5，10，15μmol/L作用24h组。E，F，G：THP10μmol/L作用12h,24h,36h组。

　　2.3DNA断裂百分率

　　SW-260细胞经THP处理后，DNA断裂百分率随THP浓度的增高或处理时间的延长而增高（图4）。以上结果说明THP能诱导体外培养的SW-260细胞发生凋亡。

图4　A:不同浓度THP对SW－260细胞DNA段裂百分率的比较

　　*P＜0.05 vs ctrl,＃P＜0.001 vs 5μmol/L组,△P＜0.001 vs 10μmol/L组。

　　B:10μmol/LTHP作用SW－260不同时间,细胞DNA段裂百分率的比较。

　　*P＜0.05 vs ctrl,＃P＜0.05 vs 5μmol/L组,△P＜0.05 vs 10μmol/L组。

　　3讨论

　　细胞凋亡是机体进化过程中的生理性死亡，它是与坏死完全不同的另一种细胞死亡的机制〔6〕，其深入研究将有助于阐明肿瘤细胞发生发展和衰亡的全过程。THP系蒽环类抗生素，是肿瘤化疗的主要用药。它既是一种细胞周期药，又是DNA复制阻滞药。其作用机制包括以下几方面：(1）与DNA结合；(2）自由基的生成；(3）与金属离子结合；(4）与细胞膜结合〔7〕。与DNA结合是由于其配基嵌入双螺旋的碱基对之间，嵌入配基的B环与C环和碱基发生作用，而配基的A环和D环则伸出双螺旋之外，嵌入的主要部位为G-C碱基对。由于上述结合，DNA作为核酸合成模板的功能受到损害。本试验证明THP可以通过诱导凋亡机制抑制细胞生长、繁殖。SW-260细胞株在THP作用后，Hoechst 33258染色荧光显微镜观察和透射击电镜观察可见出现典型的凋亡细胞形态学改变；抽提其DNA并作琼脂糖凝胶电泳则出现凋亡细胞特征性的生化学变化--“梯状”条带；细胞DNA断裂百分率增加；且以上指标随着THP浓度的增大、或处理时间的延长而逐渐加重，但是超过一定作用浓度，DNA凋亡百分率并不升高。说明THP能诱导SW-260细胞凋亡，凋亡细胞的特点为细胞缩小，DNA链断裂，染色质浓缩，核片断形成，抗癌药物能诱导肿瘤细胞凋亡而胞膜完整〔1〕。有文献报道ADR、VP16、CPT、MTX、Ara-C能诱导明显的细胞凋亡，随着浓度的增加，凋亡细胞的百分比逐步增加。若浓度继续提高，凋亡率则不再明显增加，而坏死细胞逐步增加〔5〕。

　　本实验仅探讨THP在体外对结肠癌细胞株凋亡的影响；THP在体内对细胞的凋亡的影响尚未清楚，THP诱导凋亡的机制有待进一步研究。与凋亡相关的基因如bcl-2家族、APO-1/Fas（CD95）、c-myc、p53、白细胞介素1β转化酶（ICE）家族等，目前都在研究中。凋亡机制的深入研究，将会为临床肿瘤的治疗提供新的思路和策略。

　　基金项目：本课题受湖南省卫生厅重点课题资助(编号95－68)

　　作者简介：彭旭阳　现湖南医科大学98级博士

　　〔参考文献〕

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　　〔3〕Williams GT. Programmed cell death：apoptosis and oncogenesis〔J〕.Cell, 1991,65：1097～1098.

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　　〔5〕孙晓非,佐伯公,鹤泽正仁,等.抗癌药物诱导人B淋巴细胞的白血病细胞的凋亡及周期特异性〔J〕.中华肿瘤杂志，1998，1（20）：25～27.

　　〔6〕Kerr JFB,Winterord CM,Harmon BV.Apoptosis.Its significance in cancer and cancer therapy〔J〕.Cancer,1994,73：2013～2026.

　　〔7〕韩锐主编.肿瘤化学预防及药物治疗〔M〕.第一版.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1991：268.