1　Endostatin的发现与命名

　　1997年Folkman首先报道从血管内皮瘤中提取到一种血管生成抑制物，与Angiostatin具有类似的抗肿瘤作用。随后O'Reilly将该提取液通过Lysine sepharose，发现Lysine sepga rose对血管生长无抑制作用，说明这种物质不具有Angiostatin的特性，从而证明Endostati n是一种不同于Angiostatin的新物质。经Lysine sepharose层析，SDS-PAGE电泳确定Endos tatin是分子量为20×103u的一种蛋白质，又经微测序分析确定Endostatin与胶原ⅩⅧ的N c1区有相同的末端序列，命名为Endostatin［1,2］。

　　2　Endostatin的结构与理化性质

　　正常人体内含有Endostatin,只是作为胶原ⅩⅧ的一部分存在于血管中［3,4］,后者广泛分布于血管的基膜上［5］。胶原NC1区是一以非共价键结合的三聚体。N-末端大约由50个残基构成，C-末端即是稳定的Endostatin区域,此区域大约有180个氨基酸残基,中间连接二者的为一对蛋白酶敏感的绞链区(大约70个氨基酸残基)。胶原通过水解作用,中间绞链区被蛋白酶水解而裂解,释放出有活性的Endostatin.有研究表明,胶原的裂解有几种不同的途径,这可能是结合在基质上的Endosta-tin转变为溶解形式的关键［6］。 endostatin含183个氨基酸残基,分子量为18494 Da［1，2］，X线分析结果表明其结构与C-型植物凝集素和E-选择素类蛋白家族具相似性,但它缺乏Ca2＋位点,而C a2+位点是E-选择素的特殊标志,选择素结合碳氢化合物功能的活化与它有关［ 7］。Endostatin有一富含精氨酸的区域,可能是一潜在的肝素结合位点，后者可拮抗血管生长因子结合肝素的能力［7，8］。

　　血管生成受正负信号蛋白的调节［9，10］。是什么来调节Endostatin的活性呢?有作者在含有Endostatin的溶液中发现了Zn2+位点,这个位点位于与前体裂解位点相邻的氨 基末端。围绕Zn2+形成的N-末端环将Endostatin凝聚成二聚体。无论这个Zn2+结合位点是纯粹结构意义上的还是有直接的功能意义,它都与Endostatin的活性有重要关系。目前认为Zn结合位点有直接的功能不大可能,但即使这个位点是纯粹的结构意义上的,它也可能通过影响Endostatin三级结构的稳定性而影响其活性。假如围绕Zn2+的N-末端环参与了二聚体的结构,或者这个环与目前未知的靶蛋白有相互作用，那么这个Zn2+结合位点即可更直接的影响Endostatin的活性［11］。

　　3　Endostatin抗肿瘤作用

　　Endostatin通过抑制血管生长起抗肿瘤作用，它的作用与时相有关，具浓度依赖性，肿瘤对Endostatin无抗药性，抗瘤作用与免疫应答无关。

　　3.1　Endostatin通过抑制血管内皮细胞增殖起抗肿瘤作用

　　O'Reilly先用Endostatin分别对内皮和非内皮的组织细胞进行体内试验，结果是只有内皮细胞增殖受抑制，利用重组后并纯化的Endostatin进行体外试验，证明Endostatin可抑制体外内皮细胞的增生。随后用鸡胚绒毛尿囊膜进行试验，证明Endostatin可抑制鸡胚绒毛尿囊膜的血管生长。最后用Endostat in分别对生长有Lewis肺癌，T 241纤维肉瘤和B16F10黑素瘤的小鼠进行试验，经一定时期治疗后，肿瘤消退至休眠状态，这时肿瘤是只可在显微镜下见到的微小病灶；免疫组化表明 endostatin能阻断血管生成。经这一系列实验，O'Reilly推断Endostatin通过抑制血管内皮细胞增殖起抗肿瘤作用［11］。

　　3.2　Endostatin可同时抑制原发灶和转移灶肿瘤生长

　　血管的生长是肿瘤转移的重要条件，新生的血管为肿瘤细胞提供了离开原发灶进入血流的通道，而且高含血管的肿瘤发生转移的可能远大于血管少的肿瘤。Endostatin可以通过抑制血管生成来抑制肿瘤的转移，而且对已生成的转移灶也有作用［12］。

　　3.3　Endostatin的抗肿瘤作用具浓度依赖性

　　Black W R等发现用Endostatin治疗小鼠的肿瘤时，在治疗中肿瘤局部的Endostatin浓度进行性升高，一直到这个浓度足够抑制血管生成。Black w R等推测由于Endostatin是胶原XVⅢ的C-末端片段，分子量为20×103u，它在低浓度中可能被沉积于细胞外基质中，在每一治疗周期中，类似于淀粉样蛋白沉淀于轻链疾病患者体内，从而可有效地提高Endo statin在肿瘤局部的浓度5～50倍。提示Endostatin的抗瘤作用具浓度依赖性；只有当它的浓度达到一定水平才可以抑制血管生成，起到抗肿瘤的作用［13，14］。

　　3.4　Endostatin的抗肿瘤作用与时相有关

　　Boechm用Endostatin治疗分别长有Lewis肺癌，T241纤维肉瘤和B16F10黑素瘤的小鼠，当肿瘤消退时停止治疗，这时肿瘤会重新生长，随后再次进行治疗。在分别进行6、4和2个治疗周期后，停止治疗，肿瘤没有复发。表明针对不同类型的肿瘤所需Endostatin的作用时间不同，Endostatin的抗癌作用与时相有关［14］。

　　3.5　肿瘤对Endostatin无抗药性

　　由于基因的不稳定性，表达的异质性和肿瘤细胞的高突变率，抗药性一直是癌症治疗中的一个主要问题。而内皮细胞具遗传性、稳定性、同质性和低突变率的特点。所以，从抑制血管生成的角度来治疗肿瘤是克服抗药性出现的一个好方法。Endostatin就是这样，Boechm等用Endostatin治疗小鼠的Lewis肺癌，T241纤维肉瘤和B16F10黑素瘤，分别进行6、4和2个治疗周期后，治疗停止，没有再发生肿瘤，表明这三种肿瘤对Endostatin无抗药性。但作者指出，不排除肿瘤对Endostatin具潜在耐受性。肿瘤可能产生一种降解酶，但目前还没有这方面的证据［14］。

　　3.6　Endostatin的抗肿瘤作用与免疫应答无关

　　如上所述对三种肿瘤进行不同周期治疗后肿瘤无限期处于休眠状态，Boechm等在经Endostatin治疗后的小鼠身体的远部植入与休眠肿瘤同样类型的肿瘤，经观察这三种植入的肿瘤生长迅速，没有被抑制。说明小鼠没有获得免疫力，也就是说，Endostatin的抗肿瘤作用与免疫应答无关［14］。

　　4　应用前景及研究展望

　　目前的研究表明Endostatin的抗肿瘤特性决定了它在癌症的临床治疗方面具广阔的应用前景。一是它解决了癌症常规放、化疗中最棘手的问题——抗药性的出现。二是它限制了肿瘤的转移，如果在恶性肿瘤还未开始转移时使用Endostatin，将可能对癌症患者有益。三是Endostatin的发现证实了休眠疗法，如果这种疗法与常规的放疗、化疗和外科手术等常规手段相结合，将会收到更好的效果。四是Endostatin对正常细胞及其它组织无明显影响，在所观察的时期内没有出现对机体的毒害作用，可能可以避免常规放疗、化疗和外科手术对机体的损害作用这一问题［1，14］。

　　从Folkman发现Endostatin开始，国外许多实验室进行了深入的研究，Endostatin的抗肿瘤作用已比较明确，但其作用机制还不很清楚，一些实际应用方面的问题也尚待解决。在作用机制方面，Endostatin通过抑制血管生成，切断肿瘤血供起作用，但其对正常血管生长有无影响还令人怀疑；有研究表明，Endostatin并无毒副作用，但其如何识别正常血管生长和肿瘤血管生长还无法解释；Endostatin高效地提高其在局部浓度的机理何在。在实际应用方面，Endostatin目前必须注射于皮下或腹膜内，能否口服用药以保证药物的长期效能是一个有待解决的问题；Endostatin作为生物制剂，价格昂贵；小鼠肿瘤试验的结论是否适用于人类也还需大量的试验证明［15］。

　　值得一提的是我国在血管生成抑制物的抗瘤作用的研究也走在世界的前列。1998年郭文忠等报道从人胎儿肝脏组织中首次克隆到了一种人源的肿瘤血管抑制因子（HIAF-1）。经测序并与基因库（Genebank）比较发现它为人胶原XⅧ的一部分，与Folkman等1997年从鼠内皮瘤中分离到的鼠源血管抑制因子Endostatin有80%同源。该基因经原核载体表达后为一分子量为26×103u的蛋白质，该物能显著抑制肿瘤血管形成，抑制原发瘤的生长和肿瘤的肺转移而未观察到明显的毒副作用［16］。

　　我们期待着对Endostatin更多更深入的研究，希望能早日应用于临床，造福人类！

　　作者简介：周　萍，女，23岁，检验本科学员

　　作者单位：周　萍许　雪青　综述　　(第三军医大学医学检验系951队) 重庆，400038

　　卞修武　审校　　(第三军医大学基础医学部病理学教研室) 重庆，400038

　　参考文献

　　1　O'Reilly M S, Boehm T, Shing Y, et al.Endostatin:An end ogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell，1997，88(2):277

　　2　Standker L, Schrader M, Kanse S M, et al. Isolation and characteriz ation of the circulating form of human endostatin. FEBS Lett，1997，420(2～3):12 9

　　3　Oh S P, Kamagata Y, Muragaki Y, et al. Isolation and sequencing of cDNAs for proteins with multiple domains of Gly-Xaa-Yaa repeats identify a dis tinct family of collagenous proteins. Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(10):4229

　　4　Saarela J, Ylikarppa R, Rehn M, et al. Complete primary structure of two variant forms of human type XⅧ collagen and tissue-specific differenc es in the expression of the corresponding transcripts.Matrix.Biol，1998，16(6):3 19

　　5　Muragaki Y, Timmons S, Griffith C M, et al. Mouse col18a1 is expres sed in a tissue-specific manner as three alternative variants and is localized in basement membrane zones. Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(19):8763

　　6　Sasaki T, Fukai N, Mann K, et al. Structure, function and tissue fo rms of the C-terminal globular domain of collagen XⅧ containing the angiogenes is inhibitor endostatin. EMBO J，1998，17(15): 4249

　　7　Hohenester E, Sasaki T, Olsen B R，　et al. Crystal structure of th e angiogenesis inhibitor endostatin at 1.5A resolution. EMBO J，1998，17(6):1656

　　8　Brown K J, Parish C R. Histidine-rich glycoprotein and platelet f actor 4 mask heparan sulfate proteoglycans recognized by acidic and basic fibrob last growth factor. Biochemistry，1994，33(46):13918

　　9　Hanahan D, Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angi ogenic switch during tumorigenesis.Cell，1996，86(3):353

　　10　Bouck N. P53 and angiogenesis. Biochim Biophys Acta，1996，12 87(1):3

　　11　Ding Y H, Javaherian K, Lo K M, et al. Zinc-dependent dimers obse rved in crystals of human endostatin. Proc Natl Acad Sci USA，1998，95(18):10443

　　12　Zetter B R. Angiogenesis and tumor metastasis. Annu Rev Med，1998，49:407

　　13　Black W R. Agner-rc.Tumor regression after endostatin therapy. Nature ，1998，391(6666):450

　　14　Thomas B. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not i nduce acquired drug resistance. Nature，1997，390(6658):404

　　15　Robert S K. A cancer therapy resistant to resistance. Nature，1997，390(6658):335

　　16　郭文忠.一种人源血管抑制因子的克隆及其抗肿瘤的作用.中国肿瘤，1998，7(11):21