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【摘要】
目的 考察金复康对给予致癌剂DMH（二甲肼）后大鼠结肠肠腺细胞增殖和凋亡动力学特性的影响。 方法 在DMH末次注射前3天起及末次注射后6小时，灌胃给予大鼠金复康每日1次共4次，给药24和48小时后处死动物取结肠行Feulgen染色，经肠腺微分离操作后，对单个肠腺增殖和凋亡细胞的分布行形态学观察。 结果 给予金复康主要引起结肠肠腺腺体中段增殖细胞减少，腺体凋亡细胞增加并主要出现在腺体基底部位。 结论 金复康抑制肠腺细胞增殖和促进细胞凋亡的作用是选择性的。
【关键词】 金复康 二甲肼 细胞增殖 细胞凋亡
Selective apoptosis enhancement of JinFuKang on rat colonal crypt DONG Li ,SHU Dong,WANG Jian-hui,LV Jian-ping
( TaiAn Central Hospital,Taian 271000 China )
Abstract：Objective: To study the effect of JinFuKang in rat colonal crypt mitosis and apoptosis cell kinetics after exposure to DMH,a carcinogen. Methods: Rats were administrated JinFuKang once a day for 3 days before and 6 h after the last injection of DMH, 4 times at total. 24 h or 48 h after injecton, the colon was removed , stained with Feulgen’s reagent and microdissected.The distrbution of mitosis and apoptosis cell was measured by morphological assessment. Results: The number of mitosis cells was reduced after given JinFuKang, mainly at the mid of the colonal crypt,apoptosis cells were enhanced and principally toward the base region of crypt. Conclusion: JinFuKang cause enhancement of apoptosis whereas inhibitory of mitosis, which effect is selective.
Key words：JinFuKang; DMH, cell mitosis; cell apoptosis
金复康对于二甲肼（DMH）诱导的结直肠癌癌前病变—异常腺窝病灶（ACF）具有抑制作用，该作用可能是至少部分的是由其抑制肠腺细胞增殖和促进凋亡引起［1］。本研究观察了金复康影响肠腺细胞增殖和凋亡部位的细胞生物学特性，提示金复康抑制肠腺细胞增殖和促进细胞凋亡的作用是选择性的。
1 材料和方法
1.1 实验动物
雄性Wistar大鼠（80～100g），购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于SPF级屏障动物实验室。室内温度20～25℃，相对湿度40～70％，12小时循环照明。动物在无底不锈钢丝网笼中喂养，每笼5只。动物日常护理及实验条件均符合《中华人民共和国卫生部实验动物环境及设施标准》。
1.2 主要试剂与药品
金复康口服液（江西一村制药有限责任公司， 批号：040603），
碱性品红（中国医药上海化学试剂公司， 批号：20031018），
DMH（Sigma-Aldrich Inc.， Lot ：4540061），
配制溶液所用无机盐均为国产分析纯。
1.3 仪器设备
pH计（Metrohm744， 瑞士），
光学显微镜（LEICA， 瑞士），
解剖显微镜（OLYMPUS， 日本），
相差倒置显微镜（OLYMPUS， 日本），
分析天平（Sartorius， 德国），
DK-600电热恒温水浴槽（上海精密实验设备有限公司）。
1.4实验方法
30只雄性Wistar大鼠随机分为3组：A）正常组（皮下仅注射DMH溶剂（25mM EDTA+137mM NaCl），不含DMH +蒸馏水灌胃）；B）模型组（DMH+蒸馏水）；C）金复康组（DMH+金复康1.33ml/kg体重）。
大鼠自购入后，适应1周，在第2周第1天的早晨10:00，颈背部皮下注射DMH（30mg/kg体重），正常组皮下注射等剂量的DMH溶剂。1周后各组按上述方法重复给以皮下注射1次。在第2次注射的前3天及注射后当天各组各灌胃给药1次，共4次，灌胃时间为每日下午4:00。末次注射后24和48小时分别处死每组各5只动物。
动物处死前称重，腹腔注射25%乌拉坦（0.5ml/100g体重）深度麻醉后脱臼处死，沿腹正中白线剖腹。在盲、结肠交界和骨盆处游离出整段结肠，轻轻延展后在置于台面的刻度尺上测量结肠全长。将结肠浸入生理盐水中，沿肠系膜系带由肛端向盲端纵向剖开结肠，继续在生理盐水中漂洗除去肠内容物。
取分别在结肠全长的55%处和95%处剪断而截取出的一段结肠标本，将该标本平铺在滤纸上，用乙醇：乙酸（75:25）液固定过夜，固定过夜后的结肠标本，经95%、70%、50%乙醇和蒸馏水梯度重水合、60℃ 的1M HCl酸化7分钟后用Feulgen试剂染色标本30分钟后平铺在载玻片上，在体视显微镜下，分别取在原结肠全长的55%处和95%处各约1cm的位置内摘取的结肠粘膜作为中（middle）、末段(distal)结肠粘膜标本。
将染色后的结肠行微分离（microdissection）操作［2］，用微细的分针将粘膜中的肠腺拨开。随后，取清洁的盖玻片覆盖在粘膜条上，轻压盖片使肠腺得以分散。每个标本随机挑选10只形态完整的肠腺进行观察。肠腺的长度通过已校正的显微镜目镜测微尺估算，在光学显微镜（×200）下，观察肠腺细胞增殖和凋亡情况［3］，［4］。镜检时,参照目镜测微尺刻度，将单个肠腺沿基底部至腺腔开口方向等分为1～10段，观察各只肠腺每等份中凋亡细胞和增殖细胞的数目。
上述实验通过盲法由一个有经验的观察者完成。
1.5 统计分析
实验数据以/10±s表示。使用SPSS（10.0）统计分析软件，各组增殖、凋亡数据采用一元线性模型,以单只肠腺的增殖或凋亡细胞数为应变量进行方差分析，考察各组之间增殖或凋亡细胞总数以及同一部位不同组之间增殖或凋亡细胞数量的差异性。
2 结果
2.1 末次注射DMH后24小时，中结肠肠段各组增殖细胞分布见表1。
表1 增殖细胞分布（略）
注:与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
表1数据显示给予DMH后，模型组动物结肠肠腺增殖细胞总数显著增加，而金复康组动物结肠肠腺增殖细胞总数与模型组相比差异显著，提示金复康有抑制DMH诱导后结肠肠腺细胞增殖的作用。增殖细胞数量在个别部位也显示差异，从分布趋势上看金复康主要引起结肠肠腺腺体中段细胞增殖减少。结肠肠腺干细胞位于腺体基底部，增殖活跃的细胞上行后主要出现于腺体中部位置［5］。表1显示本实验观察到的增殖细胞动力学特性与已知的结论基本一致。
2.2 末次注射DMH后24小时，中结肠肠段各组增殖细胞分布如表2所示。
表2 凋亡细胞分布（略）
注：与模型组相比：*P＜0.05，**P＜0.01
表2数据显示DMH诱导后，模型组动物结肠肠腺凋亡细胞总数与正常组相比无差异，而金复康组显示出诱导肠腺细胞凋亡的作用。凋亡细胞的分布的观察结果具有重要意义，在正常组，凋亡细胞在腺体各段呈较为均匀的分布，而在模型和金复康组，凋亡细胞则较集中的出现在靠近底部的位置，与模型组相比，金复康组凋亡细胞数主要在肠腺基底部出现差异，该部位正是肠腺干细胞存在的部位，提示金复康诱导肠腺细胞凋亡的作用是选择性的。
末次注射DMH后24小时末段结肠，48小时中、末段结肠增殖和凋亡细胞分布具有与上述相似的趋势。
为更加直观地显示凋亡细胞分布趋势，对末次注射DMH后24小时中段结肠模型组和金复康组凋亡细胞分布作柱图，如图1所示。
图1 模型组、金复康组凋亡细胞分布趋势（略）
3 讨论
金复康口服液是上海中医药大学龙华医院刘嘉湘教授研制的中药验方，为国家中药三类治疗肺癌新药。我们先前进行的实验提示其可能具有抑制结直肠癌的作用。
在抗肿瘤药物研究领域中，诱导细胞凋亡是治疗肿瘤的一条有效途径，细胞凋亡实验已经可以作为一种筛选抗肿瘤药物的快速有效的方法。凋亡的促进，能够抑制肿瘤的生成及转化，并能影响肿瘤细胞对抗癌治疗的反应。选择性地控制凋亡有望提供新的治疗策略，在肿瘤治疗中可能比单纯的抑制增殖更具有意义，且同时减少了单纯抑制增殖的毒性反应［6］。本实验采用的肠腺微分离技术为考察DMH诱导的大鼠肠腺细胞动力学研究提供了一个理想的工具，国内文献未见采用该方法进行肠腺细胞形态学考察的报道。肠腺细胞增生由位于腺体基部的干细胞起始，增殖旺盛的肠腺细胞上行并多于腺体中下部出现。在正常粘膜，凋亡细胞即使出现亦为鲜见；化学致癌剂如DMH诱导下细胞增殖增加，该现象也为本实验模型组细胞增殖结果所验证。我们观察到模型组细胞增殖增加的同时，细胞凋亡也相应增加，其原因可能是由机体增殖凋亡相对平衡的内部机制引发。在金复康组，我们观察到在DMH诱导后，给予金复康可以引起显著的抑制增殖和促进凋亡的作用。
在增殖细胞分布趋势中，三个组别的增殖细胞均多发于腺体中下段，与肠腺细胞增殖动力学特征基本相符的同时，也是对本实验方法学科学性的验证。值得重视的现象是，我们观察到在凋亡细胞分布趋势中凋亡核集中出现在腺体基部。相似的结果亦有报道［3］但并未就其原因展开探讨。本实验的结果提示，金复康促进细胞凋亡的结果是选择性的，而选择性的细胞凋亡的促进，特别是在与细胞周期失控联合时，无疑具有更重要的意义。
【参考文献】
［1］ 董立，战光绪，吴大正.金复康对二甲肼诱导的大鼠结直肠癌癌前病变的抑制作用［J］.中成药，（已录用待刊出）.
［2］ Goodlad RA，Levi S，Lee CY，et al. Morphometry and cell proliferation in endoscopic biopsies: evaluation of a technique［J］. Gastroenterology, 1991，101: 1235-1241.
［3］ Smith TK，Lund EK，Johnson IT. Inhibition of imethylhydrazine-induced aberrant crypt foci and induction of apoptosis in rat colon following oral administration of the glucosinolate sinigrin［J］. Carcinogenesis ,1998，19: 267-273.
［4］ Kerr JF，Gobe GC，Winterford CM，et al. Anatomical methods in cell death［J］. Methods Cell Biol，1995，46: 1-27.
［5］ Schon Eric A. Tales from the crypt［J］. J Clin Invest，2003，112: 1312 – 1316.
［6］ 王瑞年. 分子肿瘤学概论［M］. 第1版.上海：上海科技教育出版社， 2001.41. | 
