【摘要】 
目的  观察生脉注射液体内、外化疗增效作用。方法  体外实验采用MTT（mono-nuclear cell direct cytotoxicity assay）法，体内通过建立H22肝癌荷瘤鼠模型来观察生脉注射液联合oxaliplatin抗肿瘤活性。结果  体外研究显示oxaliplatin（大、中、小剂量）联合生脉注射液组肿瘤抑制率明显提高，分别为37.7%、39.9%和71.1%，明显高于单纯应用oxaliplatin组（20.5%、25.4%和49.0%，P<0.05），且具有较好的剂量依赖性；生脉注射液联合oxaliplatin体内可显著提高瘤重抑制率（从37.36%提高至66.90%）。结论 生脉注射液体内可提高oxaliplatin对Lovo细胞的抑制作用，体外可增强oxaliplatin的抗种植瘤效果。

【关键词】  生脉注射液；MTT比色法；增效作用；实验研究
   
In vitro and in vivo studies on the effects of Shengmai injection on efficacy enhancing of chemotherapeutic agent

YIN Yong-xiang，CHEN Zhen，LIU Lu-ming.

Department of TCM，Cancer Hospital，Fudan University，Shanghai 200032，China.

【Abstract】  Objective  To observe the effects of Shengmai injection on efficacy enhancing of chemotherapeutic agent oxaliplatin both in vitro and in vivo.Methods  In vitro and in vivo studies on the antitumor activities of Shengmai injection combined with oxaliplatin were performed by using MTT assay and H22 hepatoma bearing mice models respectively.Results  The inhibiting rates of tumor growth were improved to 37.7%，39.9% and 71.1% respectively when oxaliplatin (high，middle and low dose) combined with Shengmai injection，significantly higher than that in the oxaliplatin groups (20.5%，25.4% and 49.0% respectively，P<0.05).And there also showed dose-effect relationship in vitro.In addition，Shengmai injection can improve the tumor-weight-inhibiting rates in vivo，from 37.36% to 66.90%.Conclusion  Shengmai injection can enhance the inhibiting effects of oxaliplatin on Lovo cells in vitro.And it can also improve the antitumor efficacy of oxaliplatin in vivo.

【Key words】  Shengmai injection;MTT assay;efficacy enhancing action;experimental study

生脉注射液处方源于古方“生脉散”，此方收载于《内外伤辨惑论》，是由红参、麦冬、五味子三味药组成。具有益气养阴，复脉固脱的作用。用于气阴两亏，脉虚欲脱的心悸、气短、四肢厥冷、汗出、脉欲绝及心肌梗死、心源性休克、感染性休克等具有上述证候者。本研究通过体外药效学研究观察了生脉注射液对oxaliplatin的增效作用，并建立H22荷瘤小鼠模型以观察其体内抑瘤效应，为临床应用提供实验基础。

1  材料与方法

1.1  实验动物  雌性ICR小鼠50只，体重（20±2）g，购 于中科院上海实验动物中心，饲养于复旦大学医学院实验动物中心。

1.2  细胞株  H22肝癌细胞株，购于上海医药工业研究所。肠癌细胞株Lovo（复旦大学乳腺癌研究所邵志敏教授惠赠）。

1.3  药物  生脉注射液（上海和黄药业有限公司）;oxaliplatin（江苏恒瑞医药股份有限公司）。

1.4试剂RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司产品），含15%灭活小牛血清（华美生物制剂公司产品），400u/ml庆大霉素。MTT（mono-nuclear cell direct cytotoxicity assay）试剂液：含MTT（华美生化制剂公司产品）4mg/ml，PBS配制，0.22μm微孔过滤。二甲基亚砜（DMSO，上海上试综合经营公司）。胰蛋白酶， Sigma公司产品。

1.5  MTT法  采用增殖旺盛的肿瘤细胞，吸出培养液，加灭菌PBS液洗细胞3次，加适量胰蛋白酶消化2～3min，吸出消化液，加RPMI-1640培养液适量，吹打以均匀分散细胞，调节细胞浓度至3×104/ml，分别加入96孔培养板，每孔200μl。将培养板置于二氧化碳培养箱，在36℃、5%二氧化碳条件下培养24h，取出加试验药物。化疗药物浓度参照其在人体的最高峰值浓度，选择其最高峰值浓度的1/10～10倍范围，设为7组（第1～7组），比例分别为1∶2∶5∶10∶20∶50∶100。oxaliplatin剂量浓度为12.5μg/ml、25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、625μg/ml、1250μg/ml；生脉注射液稀释10倍、第8、9、10组分别为化疗药物体内最高峰值浓度的1/10、1、10倍与生脉注射液稀释的叠加，第11组滴加单纯生脉注射液的稀释液。每种药物浓度接种3复孔，每孔加药液20μl，使其终浓度达上述浓度，每次试验均设立对照组。再将培养板置于培养箱中，分别于24、36、72h取出培养板，真空泵吸出全部培养液，每孔加入MTT 20μl，再继续培养4h，取出，每孔加入200μl DMSO，震荡溶解沉淀，用酶标仪在570nm波长下测定光密度，计算肿瘤细胞抑制率，计算公式为：

肿瘤细胞抑制率=（对照组光密度-药物组光密度）/对照组光密度

1.6  体内实验  瘤细胞复苏后接种于小鼠腹腔内，取瘤细胞处于快速增殖期的腹水，生理盐水稀释，调整细胞浓度至2×107个细胞/ml，备用。所有动物常规消毒，沿腋下皮下注射瘤细胞悬液0.2ml，压迫止血。造模后当日随机分为5组，设对照组、oxaliplatin组、生脉注射液（大、中、小剂量）+oxaliplatin组，每组10只。oxaliplatin 6mg/kg，生脉注射液大、中、小剂量分别为14ml/kg、7ml/kg、3.5ml/kg，对照组仅给予葡萄糖液腹腔注射，每只小鼠腹腔注射总量调整至0.4ml复制模型次日起给药，连续给药14天。自第5天出现可测量的种植瘤后分别于第5、7、9、11、13、14天用游标卡尺测量肿瘤最大直径和横径，估算肿瘤体积［V=1/2（直径×横径2）］，绘制生长曲线；停药次日脱椎处死小鼠，分离瘤块，称重。计算瘤重抑制率，计算公式为：

瘤重抑制率（%）=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

1.7  统计学方法本实验数据统计均用SPSSVersion10.0完成，其中均数以（x±s）表示，组间均属比较用t检验；统计显著性水平为P<0.05。

2  结果

2.1  体外肿瘤细胞生长抑制作用  生脉注射液大、中、小各剂量与oxaliplatin联合，肿瘤抑制率明显提高，而且随剂量的增大肿瘤抑制率相应提高（P<0.05），见表1，显示生脉注射液对oxaliplatin不仅有良好的增效作用，而且具有较好的剂量依赖性。

表1  生脉注射液对oxaliplatin增效作用（略）

注：第1～7组为单纯应用oxaliplatin，剂量浓度分别为12.5μg/ml、25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、625μg/ml、1250μg/ml;第8、9、10组分别为oxaliplatin剂量浓度12.5μg/ml、125μg/ml、1250μg/ml与生脉注射液稀释液的叠加，第11组滴加单纯生脉注射液的稀释液；与1组比较，*P<0.05；与4组比较，**P<0.05；与7组比较，***P<0.05;与对照组比较，****P>0.05

2.2  各组种植瘤生长曲线  见图1。

图1  各组种植瘤生长曲线（略）

2.3  瘤重抑制率测定  见表2。表2结果显示，oxaliplatin组瘤重抑制率为37.36%，而生脉注射液（大、中、小剂量）组瘤重抑制率分别为64.80%、66.90%和65.56%，明显高于单纯oxaliplatin组（均P<0.05），说明联合应用生脉注射液可明显提高oxaliplatin的抗肿瘤效果，其中以生脉中剂量的增效作用较大，但统计学差异无显著性。

2.4  生脉注射液对H22肝癌移植瘤LOHP化疗增效减毒作用

2.4.1生脉注射液对瘤重抑制率的影响 oxaliplatin组瘤重抑制率为37.36%，而生脉注射液（大、中、小剂量）组瘤重抑制率分别为64.80%、66.90%和65.56%，明显高于单纯oxaliplatin组（均P<0.05），见表2。

2.4.2  生脉注射液对T细胞亚群的影响  H22荷瘤鼠在单独注射oxaliplatin后出现外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值降低、CD8升高，与对照组比较，经两独立样本t检验有统计学差异（P<0.05）；而生脉注射液联合oxaliplatin各组小鼠其外周血CD3、CD4及CD4/CD8比值均有所提高，与oxaliplatin组及对照组比较有统计学差异（P<0.05），见表3。

2.4.3  生脉注射液对体液免疫的影响  荷瘤鼠在注射oxaliplatin后IgG、IgM的产生明显低于对照组（P<0.05），而在联合生脉注射液治疗后可使IgG、IgM以及IgA的产生水平增高，在统计学上差异有显著性（P<0.05），见表4。

2.4.4  生脉注射液对肝肾功能的保护作用  H22荷瘤鼠在应用oxaliplatin后血清ALT(丙氨酸氨基转移酶)明显升高(72.0±20.0)u/L，而生脉注射液联合oxaliplatin应用时可使ALT一定程度降低，大、中、小剂量组分别为（52.8±11.6）u/L、(51.6±13.0)u/L、(53.9±11.6)u/L，与oxaliplatin组比较差异有显著性（均P<0.05）。ALB（血清白蛋白）、BUN（尿素氮）在各组间没有出现差异有显著性，见表5。

2.4.5  生脉注射液对骨髓造血的保护作用  荷瘤鼠在应用oxaliplatin后出现WBC明显降低，而Hb、PLT影响较小，在联合生脉注射液各组WBC数量有一定提高，与oxaliplatin组比较差异有显著性（P<0.05），见表6。

表2  生脉注射液对瘤重抑制率的影响  （略）

注：与对照组比较，*P<0.05；与oxaliplatin组比较，#P<0.05

表3  生脉注射液对T细胞亚群的影响  （略）

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01;与oxaliplatin组比较，#P<0.05

表4  生脉注射液对体液免疫的影响  （略）

注：与对照组比较，*P<0.05;与oxaliplatin组比较，#P<0.05

表5  生脉注射液对肝肾功能的保护作用  （略）

注：与对照组比较，**P<0.05；与oxaliplatin组比较，#P<0.05

表6  生脉注射液对骨髓造血的保护作用  （略）

注：与对照组比较，**P<0.01；与oxaliplatin组比较，#P<0.05

实验结果证明：生脉注射液可增加LOHP对H22肝癌移植瘤的抑制作用，提高荷瘤鼠免疫功能，减少LOHP化疗所致肝、肾、骨髓毒性反应。

3  讨论

现代药理学研究证明，人参有保护骨髓造血［1］及增强免疫作用［2］，同时人参有促进肿瘤细胞凋亡的作用［3］。麦冬能抗氧化和捕获自由基，促进物质代谢以及抗肿瘤、抗辐射作用［4］。五味子可以明显拮抗各种原因引起的肝损伤，增强肝脏解毒能力［5，6］。整个组方具有促进机体耐缺氧、耐应激、抗感染、解毒、提高机体免疫力、促进肝细胞修复等作用［7，8］。这一结果也为拓展生脉注射液使用范围提供了理论依据。

在该研究中，我们通过体外药效学实验发现单纯应用oxaliplatin其肿瘤细胞抑制率大、中、小剂量分别为0.205、0.254和0.490，而联合生脉注射液后肿瘤细胞抑制率0.377、0.399和0.711，肿瘤细胞抑制率明显提高，而且随剂量的增大肿瘤细胞抑制率相应提高（P<0.05），显示生脉注射液对oxaliplatin不仅有良好的增效作用，而且具有较好的剂量依赖性。在此基础上，我们建立了H22荷瘤小鼠模型，以观察生脉注射液的体内增效作用，结果发现联合应用生脉注射液后小鼠种植瘤生长明显减缓，瘤重抑制率提高至64.80%、66.90%和65.56%，明显高于单纯oxaliplatin组（ 37.36%，P<0.05），其中又以生脉中剂量的增效作用较大，具体机制有待进一步探讨。

通过本研究提示生脉注射液在体内、外均发挥了较好的增效作用，化疗药物联合生脉注射液应用确可以提高肿瘤抑制率，这为进一步临床研究提供了实验依据。