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摘 要 目的：探讨康莱特注射液抗肿瘤的作用机制。方法：利用MTT法分析康莱特对肾癌细胞的抑制作用，末端脱氧核苷酰转移酶法检测细胞凋亡，免疫组织化学法分析p53和bcl－2基因表达的影响。结果：康莱特抑制肾癌细胞的IC50为19.31μl/ml。5μl/ml和10μl/ml康莱特注射液具有诱发细胞凋亡的作用，细胞凋亡分别为31.30％和89.76％，康莱特浓度继续增加时，细胞凋亡的数量反而减少，15μl/ml和20μl/ml组细胞凋亡数量均低于10％。免疫组织化学证明康莱特注射液组p53基因表达标记指数为16.8％，而对照组几乎没有表达。对照组bcl－2基因表达标记指数为25％，而10μl/ml康莱特组为6.6％。结论：康莱特注射液抗肿瘤的作用是通过诱发细胞凋亡和引起细胞坏死来实现的，10μl/ml以下浓度主要是通过诱发细胞凋亡，10μl/ml时达最大值，10μl/ml以上剂量时主要是引起细胞坏死。康莱特注射液的抗肿瘤作用可能是通过上调p53基因表达和下调bcl－2基因表达。 康莱特注射液系从中药薏苡仁中提取的抗肿瘤制剂，药效学和临床应用研究结果表明该剂对多种肿瘤具有明显的抑制作用和确切的疗效[1]，但是有关康莱特注射液抗肿瘤的作用机制目前尚不清楚。本文利用肾癌细胞系探讨康莱特注射液抗肿瘤的机制，为临床肿瘤综合治疗提供理论指导。 1 材料与方法 1.1 药物与细胞培养 康莱特注射液（10％）和空白乳剂由浙江康莱特药业有限公司提供（批号93ZL－22）。四氮甲唑蓝[3(4,5－dimethy1－2－thiazolyl)－2,5－dipheny1－2Htetrazolium hromode,MTT]（美国sigma公司产）。二甲基亚砜（DMSO）（英国产）。 APO－DIRECTKit（购自美国宝灵曼公司，批号6536K）。 肾颗粒细胞癌细胞系（GRC－1）由北京医科大学第一医院泌尿研究所提供，培养基为RPMI－1640，含15％小牛血清，37℃，5％CO2培养箱中常规传代培养。 流式细胞仪：FACScan(Becton Dickson,USA)，北京医科大学第一医院检验科提供。 1.2 塞唑蓝还原法（MTT法） 取对数生长期细胞1×105/ml，每孔0.2ml，接种于96孔培养板中，设盐水对照组和不同浓度的实验组，各设6个平行孔。置37℃，5％CO2培养箱中培养72小时，实验终止前4小时每孔加MTT工作液（5mg/ml）10μl，上机前去除培养液，每孔加200μl二甲基亚砜，酶标光度计570波长测量各孔吸光度（OD值），按下式计算细胞生长抑制率： 对数几率图解法计算药物的半数抑制浓度（IC50）。 1.3 末端脱氧核苷酰转移酶（TUNEL法）标记免疫荧光染色法检测细胞凋亡 采用APO－DIRECTKit[2,3]。肾癌细胞常规培养，接进单层时加康莱特注射液0μl/ml、5μl/ml、10μl/ml、15μl/ml和20μl/ml，继续培养48小时，消化细胞，1×106细胞悬液PBS缓冲液洗2次，5％多聚甲醛固定15分钟，PBS洗1次，细胞沉淀中加TUNEL标记荧光混合染液50μl，37℃温浴1小时，PBS洗1次，加碘化丙锭(PI)20μl室温反应30分钟，直接上机检测。 1.4 免疫组织化学分析 对数生长期细胞经10μl/ml康莱特和10μl/ml空白乳作用48小时，消化细胞，涂片，放置37℃湿盒中5小时，PBS洗2次，冷丙酮固定15分钟，采用SPTM法染色，同时分别以PBS，正常兔血清代替一抗作空白对照。中山生物技术公司提供SPTM试剂盒、p53(Pab1801)和bcl－2(100)单抗。基因表达强度的判定方法：p53基因表达阳性为细胞核褐黄色染色；bcl－2基因表达阳性表现为细胞浆黄色染色。选取5个高倍视野（×400）作为观察区，求5个视野内细胞数的平均值，p53基因在细胞核和bcl－2基因在细胞浆的标记指数(labbelling index,LI)，根据以下公式计算： 2 结果 2.1 康莱特注射液对肾癌细胞的抑制作用 康莱特注射液（KLT）处理GRC－1细胞48小时后发现KLT具有抑制GRC－1细胞生长的作用，IC50为19.31μl/ml。 2.2 康莱特诱导肾癌细胞凋亡的检测 图1显示不同浓度康莱特处理GRC－1细胞48小时后，采用末端标记流式细胞分析检测康莱特诱发细胞凋亡。康莱特注射液剂量为5μl/ml时，M1区阳性细胞为31.30％，剂量为10μl/ml时，M1区阳性细胞为89.76％，而对照组为1.02％。康莱特剂量增加到15μl/ml和20μl/ml时，M1区阳性细胞的百分率分别为1.76％和8％，与对照组比较无明显差异。 2.3 康莱特对GRC－1细胞p53和bcl－2基因表达的影响 附表和图2提示，对照组肾癌细胞中几乎没有p53基因表达，康莱特组p53基因表达增加，10μl/ml组LI为16.8％。 图2 空白乳组和10μl/ml康莱特组GRC－1细胞p53基因表达的比较（×400），康莱特组GRC－1细胞p53基因表达增加阴性细胞(→)，阳性细胞（） 附表 10μl/mlKLT对GRC－1细胞p53和bcl－2基因表达的影响 分类 对照组肾癌细胞胞浆中可以测到bcl－2基因表达，康莱特组GRC－1细胞bcl－2基因表达减弱，随KLT浓度增加bcl－2基因表达减少，10μl/mlKLT时，bcl－2基因表达达最低值，结果见附表和图3。
图3空白乳组与10μl/ml康莱特组bcl－2基因表达的比较（×400）， 康莱特组GRC－1细胞bcl－2基因表达减少 阴性细胞（→），阳性细胞（） 3 讨论 肾癌是临床上治疗效果非常不理想的肿瘤，由于约87％肾癌多药耐药基因表达，所以化疗效果也不满意，如何提高肾癌的治疗疗效目前仍没有理想的治疗方法。 凋亡是指细胞独立自主地完成细胞自杀死亡过程。细胞凋亡过程由于核酸内切酶活化裂解染色质DNA，形成50～300kbp的碱基片段，然后再形成200bp的小片段，电泳分析呈特征性梯型（Ladder）。同时也可以通过末端转移酶（TdT）将异硫氰酸荧光素（FITC－dUTP）标记到DNA单链或双链的3′－羟基末端。根据荧光强度对凋亡细胞进行定量分析，而且可以区分凋亡和坏死细胞，其特异性和敏感性远较琼脂糖凝胶电泳高[2]。 许多研究报道康莱特对体内、体外多种肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。细胞周期研究发现康莱特注射液具有使细胞周期阻滞于G2＋M期，DNA合成期（S期）比例减少的作用。杨骅等[1,4]研究发现，10μl/mlKLT处理人红白血病细胞6小时后，可以诱发细胞凋亡，KLT剂量增加可以发现肿瘤细胞膜受损，PI高染色，坏死增加。利用TUNEL法检测到KLT诱导人大肠癌SW1116细胞凋亡，10μl/mlKLT时可以诱发细胞凋亡。我们的研究发现，康莱特处理肾癌细胞后具有抑制肾癌细胞增长的作用，IC50为19.31μl/ml。KLT诱发肾癌细胞凋亡，剂量5μl/ml时为31.30％，10μl/ml时为89.76％，剂量进一步增加细胞凋亡数量反而下降，提示高剂量KLT可以引起细胞坏死。由此，我们认为康莱特抗肿瘤作用具有最佳剂量效应关系，临床应用应寻找最佳剂量，进而发挥其最大的抗肿瘤疗效，合理地与肿瘤放射治疗、化学治疗联合应用提高肿瘤综合治疗的疗效。 野生型p53(wp53)具有产生抗增殖和抗转化的作用，细胞受外界损伤信号后，wp53转录水平升高，促进p21表达，p21抑制cdk活性，使细胞周期阻断于G1/S期，细胞修复损伤的DNA，如果损伤严重，无法修复，则命令细胞进入死亡程序。我们的研究发现康莱特具有上调p53基因表达的作用，p53表达增加诱发细胞凋亡。 bcl－2基因是一种能够特异地阻止细胞发生凋亡的原癌基因，在细胞凋亡中具有重要的作用。许多化疗药物的抗肿瘤活性均与下调bcl－2基因表达有关，如阿霉素、顺铂等[5,6]。有学者认为白血病细胞对化疗药物敏感性的差别取决于bcl－2的表达水平。利用I1－6、G－CSF、糖皮质激素和地塞米松诱导急性骨髓型白血病后，bcl－2基因表达受抑制，从而使阿霉素，阿糖胞苷等化疗药物对白血病细胞诱发凋亡的易感性大大提高。我们研究发现10μl/mlKLT具有抑制GRC－1细胞bcl－2基因表达的作用。许多临床研究报道KLT联合放、化疗可以明显增加放、化疗的抗肿瘤疗效，我们分析其作用机制可能是抑制肿瘤细胞bcl－2基因表达，进而提高射线和化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。 |