目的：探讨鸦胆子油抑制肝癌细胞生长的机制。

    方法：人肝癌细胞SMMC一7721培养于含10％胎牛血清、100 U-ml 青霉素、链霉素的RPMI1640培养液中。以不同浓度的鸦胆子油乳加入培养液，作用一定的时间，进行M1Tr比色实验，检测生长抑制率及分析细胞周期。

    结果：MTT比色法测定显示鸦胆子油抑制肝癌细胞的生长，随着浓度增加和作用时间的延长，抑制作用呈现逐渐增加的趋势。细胞周期分析提示：Gn-G 期比例逐渐增加，而s期比例逐渐减少，1 g•ml 组中各时间点及21xg•ml 组中各时间点均有显著差异(P<0．01)。G 一M期细胞比例减少，但差异无统计学意义(P>0．05)。

    结论：鸦胆子油抑制体外培养的人肝癌细胞的增殖，机制可能是将肝癌细胞阻滞于Go—G 期。

    肝癌是侵犯青壮年的主要恶性肿瘤之一，发病率及死亡率高。由于大多数肝癌都伴有功能性和器质性改变如肝硬化，肝炎，肝功能损害，其并发症往往是肝癌患者的主要死亡原因之一。因此导致了手术治疗及经肝动脉化疗栓塞治疗方法在一定程度上受到限制。鸦胆子油对许多肿瘤的生长有一定的抑制作用而无明显的肝功能损伤Et-23。临床应用亦证实在原发和转移性肿瘤的治疗中，鸦胆子油也显示出较好的疗效，但鸦胆子在肝癌治疗中尚缺乏系统的基础研究。本实验通过对人肝癌细胞系的体外培养，研究鸦胆子油对细胞增殖的影响，探讨鸦胆子油在治疗肝癌中的作用机理。

    1 材料和方法

    1．1 材料

    1．1．1 细胞株人肝癌细胞SMMC一7721，购自中科院药物研究所。

    1．1．2 主要试剂RPMI一1640培养液、二甲基亚砜(DM．SO)(美国GIBCO公司)、PBS缓冲液，RNA酶，碘化丙啶。鸦胆子油静脉乳剂(0．1mg／ml，沈阳药科大学制药厂)，MTr(美国Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青生物材料研究所)。

    1．1．3 主要仪器二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、酶标仪、96孔板、全自动化学发光仪。FACSCalibur型流式细胞分析仪。

    1．2 方法

    1．2．1 细胞培养SMMC一7721用1640培养液在37℃ 、5％ CO 及饱和湿度的条件下培养，实验时取对数生长期细胞。

    1．2．2 细胞周期同步化收集处于对数生长期的细胞，制成单细胞悬液，接种后过夜，弃原培养液，用无Ca ／Mg 的PBS液洗3次，接种于不含血清的培养液，使其处于血清饥饿状态，24小时后绝大多数细胞处于G。／G 期，便达到细胞周期同步化。

    1．2．3 MTT检测将1×10 ／ml细胞接种于96孔板，经药物处理并培养一定时间后，每孔加入2．5mg／ml MTI试剂201xl，孵育4h，加入200p,1 DMSO，放震荡器震荡15min，使沉淀盼结晶充分溶解，用酶标仪(测定波长490nm，参考波长570nm )测定每孔OD值，按下列公式计算抑制率：抑制率=(1一实验组平均OD值／对照组平均OD值)×100％ [3 ]。

    1．2．4 细胞计数细胞悬液加2％台盼蓝染液混匀后，用细胞计数板计数话细胞。

    1．2．5 流式细胞仪测定细胞周期时相分布及细胞凋亡鸦胆子油乳剂以不同浓度分别孵育SMMC一7721不同时间，并以质量分数10％ RPMI1640细胞培养液替代鸦胆子油乳作阴性对照，按时收集不同质量浓度处理的SMMC一7721，胰酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗涤后，离心，加入一20℃ 预冷的无水乙醇固定30min，离心除去乙醇，PBS洗涤，加入碘化丙啶溶液400p,l，4℃作用20min后，进行FACSCalibur流式细胞仪检测，资料均经Lysis软件收集和分析。

    1．3 统计学分析

    采用spss 8．0软件包进行数据分析。

    2 结果

    2．1 鸦胆子油对人肝癌细胞株SMMC一7721增殖的影响低浓度(0．0625 g•ml )的鸦胆子油对人肝癌细胞株SMMC一7721就有抑制作用，随着鸦胆子油浓度的增加，其抑制作用明显增强，当鸦胆子油浓度为2 g•rnl 时，作用12小时抑制率可达到63．98％ ，作用36小时抑制率可达到94．46％。鸦胆子油的抑制作用呈量效依赖关系及时间依赖关系。

    2．2 鸦胆子油对人SMMC一7721细胞周期分布的影响

    对照组孵育不同时间Go—G，，S及G 一M期细胞比例无显著差异(P>0．05)。鸦胆子油乳在同一浓度条件下，随着药物作用时间延长，Go—G 期比例逐渐增加，而s期比例逐渐减少，1txg•ml。。组各时间点比较及2 g•ml 组各时间点比较均有显著差异(P<0．O1)。G-M期比例亦逐渐减少，但差异无统计学意义(P>0．05)。在同一时间点，随着药物浓度增加，细胞周期的变化亦呈现上述趋势。表明鸦胆子乳剂主要使SMMC一7721阻滞在Go —G。。而且，在鸦胆子油乳2 g•ml 浓度和1 g•ml 浓度作用下，流式细胞仪DNA直方图未出现典型的亚二倍体的凋亡峰，提示鸦胆子抑制SMMC一7721肿瘤细胞生长并不是通过诱导细胞凋亡实现的。

    3 讨论

    鸦胆子为苦木科植物鸦胆子的成熟果实，鸦胆子油是鸦胆子果实用石油醚提取所得的脂肪，以大豆磷脂为乳化剂，制成的油水型静脉注射用乳剂，曾经用于治疗阿米巴痢疾等疾病。基础研究表明：鸦胆子油的主要成分可分为水溶性和脂溶性两部分，水溶性成分主要是四环三萜类化合物。脂溶性的成分无毒，其中油酸，亚油酸被认为是抗肿瘤的活性成分。鸦胆子油乳为细胞周期非特异性抗肿瘤药，对多种肿瘤细胞如大肠癌，胃癌，膀胱癌，宫颈癌，卵巢癌，白血病等各期均有杀伤和抑制作用，能明显抑制肿瘤细胞的合成，与化疗及放疗合用有增效减毒作用。其可能的作用机制包括直接损伤膜结构，阻滞细胞周期，特异性抑制拓扑异构酶的活力，对多种药物的耐药有逆转作用，通过调节机体免疫等作用杀伤肿瘤，及降低MMP、诱导细胞色素c释放，诱导肿瘤细胞发生坏死与凋亡等 ，对于某些肿瘤细胞，其抑制作用超过化疗药物 J。鸦胆子中不饱和脂肪酸，特别是油酸、亚油酸，能抑制癌细胞对氧的摄取，导致细胞死亡。同时脂肪酸具有的表面活性对癌细胞有毒性作用，可通过影响线粒体的通透性变化，细胞色素c的释放，影响磷酸酪氨酸酶等机制，而可导致细胞膜的破裂及细胞死亡 。

    本研究结果显示：鸦胆子油乳在体外能够明显抑制SMMC一7721的增殖。M1Tr结果表明，鸦胆子油乳剂对细胞增殖的抑制随其质浓度的增高和作用时间的延长而增强。细胞周期实验证明鸦胆子油乳剂具有阻滞SMMC一7721增殖周期的作用，且SMMC一7721的细胞周期改变为G0-G。期细胞的增加和S期细胞的减少，与对照组相比差异显著(P<0．O1)，并且这种G0一G。期阻滞作用随药物作用时间延长和浓度的增高而增强。

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