实体肿瘤的生长及存活依赖新生血管形成(angiogenesis)，这已被广大的肿瘤学家所公认。肿瘤血管形成研究的先驱，美国哈佛大学医学院儿童医院JudahFolkman博士早在20世纪70年代就提出了肿瘤生长依赖于新生血管的理论，并提出通过抑制血管生长、切断营养供给而达到抑制和消除肿瘤的设想。目前，按照这一理论，利用血管形成抑制剂治疗肿瘤已成为其治疗的一个新的途径和手段，是世界范围内肿瘤治疗领域中最热门的课题之一。其中，血管内皮抑制素(Endostatin)是第一个进入临床研究的内源性血管生成抑制剂，目前国外已完成工期临床试验，并已开始进行Ⅱ期临床研究。

本文就恩度Endostatin临床前和临床研究进展作一综述。

1血管形成及血管形成抑制剂

1．1Folkman的理论1971年，Folkman博士在新英格兰医学杂志上首先提出了关于肿瘤血管形成以及通过抗血管形成(anti—angiogenesis)抑制肿瘤生长’的假设[1。]

主要有以下几点：
①早期肿瘤生长可以不依赖于新生血管的发生，当肿瘤直径大于1～2mm时，简单扩散方式已经不能保证其生长所需的氧及营养供应；
②肿瘤直径生长达到大于1～2mm时，肿瘤细胞可以引起周围的血管内皮细胞开始增殖、迁移，在肿块内形成新的毛细血管，以保证肿瘤继续生长和转移；
③肿瘤新生血管的发生来自肿瘤血管形成因子(tumorangiogenesisfactor，TAF)的产生；④可以通过抑制肿瘤血管的形成来达到抑制肿瘤生长的目的。例如，可以通过抑制TAF的产生，或者直接靶向新生的毛细血管内皮细胞；
⑤抑制肿瘤血管的形成不能消除所有的肿瘤细胞，但能阻止肿瘤细胞的生长，这种治疗方式称为“诱导休眠”。
1．2现有的血管形成抑制剂经近几十年来的研究，证实了肿瘤血管的形成依赖血管内皮细胞的激活、增殖、吸附和成熟过程，所有这些过程都可以成为血管形成抑制剂作用的靶点。

目前约有30余种肿瘤血管形成抑制剂进入I～Ⅲ期临床试验。根据作用机制不同主要有以下三类：

①抑制、干扰血管内皮细胞的生长：此类血管抑制剂是目前研究、应用最多、最成功的一类，包括TNP一470(AGM一1470)、反应停(Thalidomide)、凝血栓蛋白一1(Throm—bospondin-1、TSP一1)、Endostatin、血管抑素(An—giostatin)等直接作用于血管内皮细胞的药物，还有抑制、阻止TAF的产生和作用的药物，如抑制成纤维细胞生长因子一2(FGF一2)、血管内皮生长因子(VEGF)的药物SU5416、抗一VEGF抗体等。

②干扰血管内皮细胞附着、迁移：抑制血管内皮细胞迁移、附着信号的传递可以抑制肿瘤新生血管的形成，例如抗整合素(Integrin)抗体。
③作用于金属蛋白酶：毛细血管内皮细胞迁移至肿瘤细胞时，需要金属蛋白酶参与肿瘤细胞外基质的降解，以便内皮细胞侵蚀、迁移，抑制金属蛋白酶的活力从而抑制肿瘤新生血管的形成，此类药物有Batimastat、Marimastat及PEX。

开关平衡假说(theangiogenicswitch)，认为血管形成是受自身存在的抑制肿瘤血管生长的因子，包括Angiostatin、Endostatin、血小板因子-4(PF-4)、TNP一470、TSP-1、白介素-12(IL-12)等，与促进肿瘤血管生长的因子如VEGF、bFGF、血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)等共同调控的结果。在正常情况下二者处于动态平衡，当人体产生肿瘤时这种平衡被打破。O’Reilly博士继1994年报道发现了第一个内源性血管形成抑制剂Angiostatin后，又于1997年报道发现了Endostatin。

恩度Endostatin是内源性血管形成抑制因子之一，最初是从体外培养的鼠血管内皮瘤细胞系的培养液中提取[5]。进一步分析发现，Endostatin是胶原XⅧ(CollagenXⅧ)C端一个20kd的片段，由184个氨基酸组成。鼠Endostatin1．5晶体结构显示为一紧密折叠的结构，与肝素的亲和性是由于它表面有11个精氨酸组成的碱性区[6]。Endostatin作用机制仍不明确。

Vuori等[7认为与抑制Integrin活力有关。Endostatin作用的毛细血管内皮细胞受体尚未发现。Macdonaldc认为Endostatin的受体为毛细血管内皮细胞的原肌凝蛋白(Tropomyosin)，En—dostatin与受体结合抑制毛细血管内皮细胞迁移。

Sasaki[1通过对Endostatin肝素结合位点点突变研究，证明Arg155、Arg158、Arg184、Arg270、Argl93及Arg194是肝素结合所必需的，同时证明肝素结合位点是鸡胚尿囊膜(CAM)血管生长／抑制所必需的。推测Endostatin的血管抑制活力与bFGF受体的竞争性结合有关，认为Endostatin竞争性抑制了bFGF的促血管生长活力。Dixeliusll认为En—dostatin激发了shb受体酪氨酸磷酸化途径，促使血管内皮细胞凋亡。Dingl1报道EndostatinN端有Zn结合位点。Boehm[1]认为结合Zn是En—dostatin血管抑制活力所必需，然而，Yamajachi及Sasaki认为Zn与Endostatin的生成有关，参与Endostatin的结构组成，但不是血管抑制活力所必需的]。

2．2临床前药效学研究Hohenesterl6采用人肾细胞293一EBNA表达重组的恩度Endostatin，具有血管抑制活力。Dhanaba报道[7采用毕氏酵母(PichiaPastoris)表达人Endostatin，经肝素纯化可获得重组人血管内皮抑制素(rh—End6§tatiri)，此系统的rh-Endostatin收率为10mg／L发酵液。

EntreMed公司报道l1。他们采用毕氏酵母表达体系规模生产rh-Endostatin，收率可达300mg／L酵液。O’Reilly报道[5采用E．coli生产的重组鼠En—dostatin的肿瘤生长抑制率达99，加快了肿瘤细胞的凋亡而使肿瘤处于休眠状态。

Boehm[1报道采用E．coli生产的重组鼠Endostatin包涵体治疗小鼠肿瘤，在经过几轮给药后肿瘤被完全抑制，不再生长。Boehm同时指出恩度Endostatin没有毒性，并且不产生耐药性。Dhanabal报道[1采用毕氏酵母表达鼠Endostatin可抑制小鼠肾癌细胞生长，抑制率可达97。Perlettic。采用E．coli生产的大鼠En—dostatin包涵体对大鼠原发性乳腺癌生长有明显抑制作用。Chen及Feldman、Bernhard报道采用En—dostatin基因治疗方法，可以抑制小鼠肿瘤的生长[21-23]。

EntreMed公司采用毕氏酵母表达的rh—En—dostatin对小鼠Lewis肺癌的抑制率未达到O，Reilly和Boehm采用E．coli生产的重组鼠En—dostatin包涵体99的抑制率的结果，他们认为是由于人Endostatin与鼠Endostatin在序列上有15的差异造成的，同时在小鼠体内观察到抗体的产生口引。最近，Folkman报道采用连续皮下给药方式使EntreMed公司的rh—Endostatin对小鼠Lewis肺癌的抑制率从30提高到99。
2．3临床前药理学研究EntreMed公司报道了Ez4,z53他们采用毕氏酵母表达的rh-Endostatin的动物毒理及药代动力学研究结果。

采用皮下或静脉途径给猕猴注射单剂量rh—Endostatin100mg／kg未观察到毒性反应。1h静脉滴注给药300mg／kg，未观察到急性毒性反应，采用4．5、150、300mg／(m·d)，连续给药28d也未发现毒性反应。在鼠及猕猴体内的药代动力学研究表明，给鼠一次性皮下注射rh-Endostatin1．5mg／kg和50mg／kg，血药浓度分别为161ng／ml及4582ng／ml，生物利用度为100。猕猴皮下给药的生物利用度为60，静脉给100mg／kg，24h后血药浓度为604ng／ml。同时，美国国立卫生研究院(NIH)的Berger等认为恩度Endostatin不影响鼠皮肤伤口愈合。

3Rh-EndostatinI期临床研究

美国EntreMed公司于1998年1O月至2000年7月进行了rh—Endostatin的I期l临床研究，分别在美国马萨诸塞州波士顿哈佛癌症中心(Dana—Farber)、德克萨斯州休斯顿MDAnderson癌症中心和威斯康星州麦迪逊威斯康星大学综合癌症中心进行。

药物来源均为EntreMed公司采用毕氏酵母表达的rh—Endostatin。
3．1安全性研究参加I期l临床试验的晚期肿瘤病人有61例，2O多种肿瘤类型。采用每天静脉输注rh—Endostatin20min或1h，每28d为一周期，如未发现严重不良反应或未出现疾病进展则继续给药，最低起始剂量15rag／mz，最大剂量600mg／m。

经400多次给药，结果发现：
①rh—Endostatin在人体是安全的，耐受性好，未发现剂量限制性毒性(DLT)和最大耐受剂量(MTD)。1例病人出现室上性心动过速和胸部不适，检查发现有明显的冠状动脉病变。因为考虑到Endostatin可能影响心脏血管形成，该例病人剔除。
②疗效方面，未观察到肿瘤缓解。1例胰腺非分泌型神经内分泌肿瘤广泛肝转移病人肿瘤缩小17，并持续11个月。另有1例结肠癌和1例软组织肉瘤病人肿瘤分别稳定了4个月和3个月。1例多发皮肤转移的恶性黑色素瘤病人治疗了426d，病变稳定，生活质量明显改善。1例复发的滑膜肉瘤病人治疗期间下颌下病灶缩小6O，伴疼痛明显减轻和头部活动改善，但颞下病灶增大1009／5。
③检测病人尿液中bFGF和VEGF水平治疗前都在正常范围，治疗后部分增高部分下降，但与rh—Endostatin剂量无关，也与治疗疗程无关。治疗前后测血清bFGF、VCAM和E一选择素水平没有明显变化。有几例患者血中VEGF水平给药后有下降趋势，但没有统计学意义。
④通过CT、增强MRI及PET扫描未观察到应用rh—Endostatin后肿瘤血流量及葡萄糖代谢量降低。
⑤治疗2周后可检测到低滴度的抗体(包括IgG、IgM)，但抗体并不影响rh—Endostatin的血清峰浓度C⋯和谷浓度C。，对疗效的影响有多大还需进一步研究。

3．2药代动力学研究3个研究均检测了给药前病人循环中Endostatin浓度，分别为(20．4±9．7)ng／ml、(27．6±12．9)ng／ml和(18±9)ng／ml。给药后，rh—Endostatin在体内分布呈二室开放模型，血中C、C和曲线下面积(AUC)随剂量增加而呈线性增高。在给予较高剂量rh—Endostatin的病人，C、AUC值均达到l临床前研究中观察到的出现抗肿瘤效应的水平[分别为59．4ttg／ml和600～700ng／(ml·rain)]。平均消除半衰期(t／2日)为(10．7±4．1)h，平均血浆清除率(cL)为(408±127)ml／(min·m)。血浆清除率与体表面积无关。平均稳态分布容积(V)为(50．4±25．2)L／m。谷浓度随剂量水平增加而增加。

重复给药几乎没有药物累积。

4Rh—EndostatinⅡ期临床研究美国EntrdMed公司于2002年1O月正式启动了rh—Endostatin的Ⅱ期临床试验。有关Ⅱ期l临床试验的情况迄今未见正式报道。
5小结和展望
恩度Endostatin是第一个进入临床试验的内源性血管形成抑制剂。大量临床前研究显示其有广谱抗肿瘤作用而毒性轻微，并且不产生耐药性。工期l临床研究发现采用毕氏酵母表达的rh—Endostatin在人体是安全的，即使剂量高达600mg／m也未发现剂量限制性毒性，并已初步观察到肿瘤对其有一定的反应。还需进行Ⅱ期临床研究明确其疗效。试用其他给药途径如多次皮下给药或持续静脉滴注，或rh-Endostatin联合应用其他治疗方法如放疗、化疗或其他TAI如angiostatin等都有待进一步研究。肿瘤血管形成抑制剂是新靶点治疗药物，它代表了一类新的生物工程抗癌治疗药物，目前已为广大学者和专家接受。

随着新的血管形成抑制剂不断地从实验室进入临床，既给肿瘤病人带来了希望，也对肿瘤学家提出了新的挑战。
因为：
①肿瘤的异质性和肿瘤释放的血管形成促进因子的多样性，不可能有任何一种TAI能有效治疗所有肿瘤。
②肿瘤晚期将释放大量的血管形成促进因子，因此要获得理想的疗效，应尽可能早期用药。
③内皮细胞的多样性也将影响TAI的临床疗效。肿瘤的发生发展机制极其复杂，单用某一类药物难以获得理想的效果，所以使用TAI，或联合其他治疗手段，将是抗肿瘤治疗的理想方案。