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沙利度胺对人乳腺癌细胞血管内皮生长因子c及其受体表达的影响

2010-08-24 13:16:25 作者：新特药房来源：河北医科大学第四医院肿瘤内科浏览次数：93 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 【摘要】目的探讨沙利度胺对人乳腺癌细胞系mcf7和mdamb231 vegfc及kdr表达的影响。方法 mtt法检测沙利度胺对细胞增殖的抑制作用，从而选择适当的药物浓度及作用时间；rtpcr法检测沙利度胺 ...

【摘要】
目的探讨沙利度胺对人乳腺癌细胞系mcf7和mdamb231 vegfc及kdr表达的影响。方法 mtt法检测沙利度胺对细胞增殖的抑制作用，从而选择适当的药物浓度及作用时间；rtpcr法检测沙利度胺处理前后细胞中vegfc mrna的表达水平；流式细胞术检测沙利度胺处理前后细胞中vegfc及kdr蛋白的表达水平。结果沙利度胺在（6～120）μg/ml范围内对mcf7和mdamb231细胞有明显的抑制增殖作用，60μg/ml明显抑制两株细胞的vegfc mrna 及vegfc、kdr蛋白的表达。结论沙利度胺在一定浓度范围内能抑制人乳腺癌细胞的增殖，其抗血管生成作用可能与下调vegfc及kdr表达有关。

【关键词】乳腺癌沙利度胺血管内皮生长因子 c kdr

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, vegf)在恶性肿瘤的血管生成及转移扩散中起重要作用，血管内皮生长因子c（vascular endothelial growth factorc,vegfc）作为vegf家族的新成员，不仅具有刺激血管生成的作用而且是该家族中唯一能够调节淋巴管生理功能的因子。在乳腺癌、胃癌等多种肿瘤组织中均有表达[1,2]。沙利度胺（thalidomide,反应停）曾因致畸作用而被禁用，在近年的研究中发现其具有明显的抗血管生成等作用，从而作为一种具有抗肿瘤潜能的药物重新引起人们的重视。目前沙利度胺作为血管生成抑制剂的研究主要集中在对vegf的表达影响，尚无对vegfc表达影响的相关报道。本实验旨在研究沙利度胺对人乳腺癌细胞vegfc及其受体kdr (kinase insert domain containing receptor)的表达影响，从基础实验角度探讨沙利度胺抗血管生成作用的可能机制及其用于治疗乳腺癌的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌细胞mcf7（er、pr均为阳性）和 mdamb231（er、pr均为阴性）均由河北医科大学第四医院科研中心提供。沙利度胺（±）thalidomide为sigma公司产品，批号093k461, 终浓度为50mg/ml。二甲基亚砜（dmso）为天津泰兴试剂厂产品。dmem培养基、胰蛋白酶和trizol reagent为gibco公司产品。四甲基偶氮唑蓝（mtt）、rtpcr试剂盒及胎牛血清均为华美生物工程公司产品。引物序列由北京赛百盛生物工程公司设计合成并纯化。兔抗人vegfc、鼠抗人kdr多克隆抗体为北京中山生物有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 人乳腺癌细胞增殖抑制实验人乳腺癌细胞用dmem培养液（含10%胎牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100u/ml）置37℃、5%co2和饱和湿度条件下培养，倒置显微镜下观察细胞形态良好无退化,每3～4天传代,隔日换液。取对数生长期的细胞，以1×105/ml密度接种于96孔板，100μl /孔。继续培养24h后小心吸出各孔内培养液，设置对照组、空白组及沙利度胺不同浓度组（6、30、60、120μg/ml）观察量效关系，同时设置不同时间组（24、48、72h）观察时效关系。每孔均为100μl，每组均设3个复孔，置于co2培养箱中，37℃继续培养，培养结束前4h，各培养孔加入mtt（5mg/ml）10μl，4h后弃上清，每孔加入10% dmso100μl，振荡器震荡10min后，用全自动酶标仪检测各孔光密度值，计算抑制率（ci，%）=（对照组光密度值－实验组光密度值）/（对照组光密度值－空白组光密度值）×100%。上述实验重复3次。

1.2.2 半定量rtpcr法检测细胞vegfc mrna的表达细胞总rna的提取：取对数生长期的细胞，细胞密度为每个培养瓶2×106个，设置对照组及实验组，根据mtt的结果，为便于进行基因和蛋白水平的观察，实验组选取沙利度胺体积浓度60μg/ml组作用48h后检测对vegfc mrna的表达影响，各组均重复3瓶。用trizol提取细胞总rna，紫外分光光度计分析rna含量，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性。半定量rtpcr法：利用rtpcr酶混合物试剂盒（含mumlv逆转录酶、taqdna聚合酶和核糖核酸酶抑制剂），通过一步法进行逆转录及pcr扩增。vegfc引物序列：上游为5′ggccccaaaccagtaacaatc3′。下游为5′ggggcaggttcttttacatacac3′。扩增片段长度为462bp，退火温度为52℃；内参照物βactin引物序列：上游为5′atctggcaccacaccttctacaatgagctgcg3′，下游为5′cgtcatactcct gcttgctgatccacatctgg3′，扩增片段838bp，退火温度为60℃。逆转录及pcr扩增反应体系为：rtpcr酶混合物2.0μl，20×buffer1.5μl，4×dntp1.2μl，mgcl22.0μl，引物上下游各1μl，总rna 2μg，蒸馏水定容至总体积30μl。半定量rtpcr扩增产物的定量分析：取5μl扩增产物，琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统分析图像，读取各条产物带的光密度值，vegfcmrna表达相对值=vegf光密度值/βactin光密度值。

1.2.3 流式细胞术检测细胞vegfc、kdr蛋白表达取对数生长期的细胞，细胞密度为2×106/瓶，分组同rtpcr，各组均重复3瓶。常规收集细胞，70％冷乙醇固定后，分别加入vegfc及kdr多克隆抗体，室温孵育30min，洗3次后分别加入羊抗兔fitcigg、羊抗鼠fitcigg二抗工作液，流式细胞仪测定vegfc及kdr蛋白表达情况，以荧光指数（fi）表示蛋白含量，fi＝样品蛋白表达的平均荧光强度/对照样品平均荧光强度。

1.3 统计学分析用spss13.0统计学软件进行数据处理，数据以±s表示。以p<0.05为差异有统计学意义。采用方差分析、t检验及pearson相关分析。

2 结果

2.1 沙利度胺对mcf7和mdamb231细胞增殖的影响

沙利度胺在一定范围内能抑制mcf7和mdamb231细胞增殖，抑制率见表1。随着浓度增加抑制率升高，且均以120μg/ml组作用48h抑制率最高。不同浓度组作用48h后对mcf7细胞抑制率各组比较差异具有统计学意义（p<0.05）；对mdamb231细胞抑制率各组比较差异具有统计学意义（p<0.05）。表1 沙利度胺对mcf7细胞增殖反应抑制率(ci,%)

2.2 沙利度胺处理mcf7和mdamb231细胞前后vegfc mrna的表达半定量rtpcr结果，见图1，沙利度胺60μg/ml浓度组作用48h对mcf7和mdamb231细胞vegfcmrna表达抑制显著，处理前后测得vegfcmrna相对值统计学分析均有差异（p<0.05）。

m: marker；1:mcf7 control group；2:mcf7 60μg/ml group ；3:mdamb231 control group；4:mdamb231 60μg/ml group 图1 rtpcr分析vegfc mrna表达结果

2.3 沙利度胺处理mcf7和mdamb231细胞前后vegfc、kdr蛋白的表达

流式细胞术结果见表2，显示沙利度胺60μg/ml浓度组能抑制两株细胞vegfc、kdr蛋白表达，处理前后蛋白荧光指数（fi值）比较差异均具有统计学意义（p<0.05）。两株细胞vegfc与kdr蛋白表达具有相关性（mcf7：r=0.903,p=0.014；mdamb231:r=0.874,p=0.023）。表2 沙利度胺对乳腺癌细胞vegfc、 kdr表达的影响(fi值)

3 讨论

血管内皮生长因子家族由vegfa（或vegf）、vegfb、vegfc、vegfd、vegfe及胎盘生长因子（placenta growth factor, pigf）等6个成员组成，这些因子都与血管生成有关。其中vegfa被认为可能是最强的促血管生成因子。vegfc与vegf具有高度的同源性，研究表明，vegfc不仅与vegf功能有相似之处，具有诱导新生血管生成的作用[3]，而且在淋巴管系统发育中起重要调节作用[4]。vegfc可在人类多种肿瘤组织中表达，人们推测其可能与肿瘤细胞的淋巴管扩散有关[5,6]。vegf家族的各因子需与细胞表面的血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor, vegfr）结合后通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在已发现的3种受体中，vegfr2(kdr)是vegf、vegfc的共同受体，是血管生成中的主要调节者[6,7]。

近年来，以血管内皮生长因子家族及其受体为靶点的抗肿瘤研究进展迅速，已有不少药物进入临床试用阶段，其中沙利度胺是2001年后期进入临床的血管生成抑制剂，其抗肿瘤机制尚不十分清楚。国内已有学者报道，沙利度胺可下调乳腺癌细胞中vegf的表达，抑制肿瘤细胞的增殖[8]。本实验结果显示一定浓度的沙利度胺可抑制vegfc、kdr的表达，且与细胞受体状态无关，提示沙利度胺可能通过下调vegfc、kdr的表达来发挥抗血管生成作用，同时沙利度胺可能具有抗淋巴管生成的作用,这对于易发生淋巴管转移的肿瘤具有重要意义。已有证据表明，肿瘤中可能存在vegf的自分泌机制，从而刺激肿瘤细胞的体外增殖，kdr介导了这一自分泌功能[6,9]。本研究显示，沙利度胺可抑制人乳腺癌细胞体外增殖并呈浓度依赖性，同时kdr蛋白表达也受到抑制。有研究显示诱导细胞凋亡是沙利度胺抑制乳腺癌细胞增殖的机制之一[8]，本实验提示阻断kdr介导的自分泌途径可能亦为沙利度胺直接抑制肿瘤细胞增殖的机制之一。

乳腺癌淋巴结受累程度是影响预后的关键指标之一。体外实验证实沙利度胺对人乳腺癌细胞vegfc及kdr表达有抑制作用，且不受细胞受体状态的影响，从而为沙利度胺在抗乳腺癌血行及淋巴管转移中的应用提供了理论依据，并为乳腺癌的综合治疗提供了新的选择。