【摘要】CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+ regulatory T cells, CD4+CD25+ Tregs)可抑制机体对肿瘤的免疫应答，导致不利于肿瘤患者的对肿瘤的免疫耐受。以降低CD4+CD25+Tregs作用，增强对肿瘤的免疫应答为新策略的肿瘤免疫治疗探索已有初步进展。方法包括去除CD4+CD25+Tregs、单克隆抗体、蛋白分子转移、阻断Tregs的迁移和分化、逆转Tregs的分化、阻断Tregs的功能、疫/瘤苗、将Tregs调控与其他治疗模式相组合、提升抑制效应细胞的阈值。

【关键词】  CD4+CD25+调节性T细胞; 肿瘤; 免疫治疗

调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs)包括自然Tregs(normal regulatory T cells,n Tregs)以及适应性Tregs(adaptive regulatory T cells,a Tregs)。自然Tregs大部分为CD4+CD25+Tregs。CD4+CD25+Tregs的重要功能为其无反应性和抑制功能。近年来对CD4+CD25+Tregs与肿瘤免疫的研究日益加强，并开始初步开展与CD4+CD25+Tregs相关的肿瘤免疫治疗探索，现就其与肿瘤关系的基础研究概述和在肿瘤免疫治疗中的应用两方面的新进展作一综述。

1 Tregs与肿瘤关系的基础研究概述

1.1 CD4+CD25+Tregs抑制抗肿瘤应答

CD+4CD+25Tregs在维持生理的免疫耐受方面发挥重要作用，但也可抑制机体对肿瘤的免疫应答，导致不利于肿瘤患者的对肿瘤的免疫耐受。在肺癌、胰腺癌、乳癌、肝癌以及皮肤癌患者的外周血以及肿瘤内均发现大量的CD4+CD25+Tregs。可能为肿瘤启动抗肿瘤免疫的同时诱导出本能的抗自身免疫性的保护机制[1]。Grauer等[2]发现鼠和人的CD4+CD25+Tregs均可抑制对机体有利的抗肿瘤应答。浸润入肿瘤中的Tregs 可能为适应性CD4+CD25+Tregs，但尚不清楚其是否是从自然CD4+CD25+Tregs分化而来。Nomura等发现在各种淋巴瘤中Tregs可抑制抗肿瘤的CD+8T细胞的免疫应答，这与Tregs在别的实体瘤中观察到的作用类似。除去Tregs可提高肿瘤免疫疗法的疗效，这些肿瘤免疫疗法包括过继免疫治疗，细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte–associated antigen 4 ，CTLA-4)阻断，除去Tregs甚至能增强对脑肿瘤的免疫排斥。Zhou 等发现自然Tregs调节外周的自身耐受，而诱导Tregs能抑制炎症。因此肿瘤中自然Tregs增加以抑制抗肿瘤免疫，诱导Tregs也增加以抑制炎症。二者均对肿瘤的免疫耐受发挥作用。Chen[3]等发现Tregs可抑制肿瘤特异性CD+8、CD+4T细胞的抗肿瘤效应功能，其机制包括细胞-细胞接触和/或产生如IL-10或TGF-β这样的可溶因子，但尚未完全搞清。nTreg在体外抑制依赖与靶细胞的细胞接触，Tregs直接抑制NKG2D调节的NK细胞毒作用，很大程度上是通过TGF-β依赖机制和IL-10非依赖机制。Tregs能有效地抑制NK细胞调节的肿瘤排斥。

CD4+CD25+FoxP3+Tregs, CD8+Tregs等在卵巢癌中浸润的细胞可对抗抗肿瘤免疫。免疫浸润的细胞成分由细胞因子、趋化因子、抗原、主要组织相容复合分子和协同刺激分子决定。

Woo等报道卵巢癌中含分泌抑制性细胞因子转化生长因子-β(TGF-β)的CD4+CD25+T细胞，该细胞可能抑制肿瘤相关的CD8+T细胞，使其功能受损。

还有CD4+CD25+Tregs募集及抑制抗肿瘤应答的机制报道，Curiel 等发现肿瘤细胞及其周围的巨噬细胞可产生细胞因子CCL22，CCL22通过CCR4调节Tregs募集到肿瘤的过程，这也是肿瘤免疫逃逸的原因。在B细胞NHL肿瘤内的Tregs可抑制浸润的CD4+CD25-T细胞分泌抗肿瘤的IFN-γ和IL-4。

然而，Prabhala等发现将Tregs增加到更高比例时，多发性骨髓瘤和意义未明单克隆球蛋白血症病人的Tregs也不能抑制抗CD3调节的T细胞扩增。

1.2 Tregs与肿瘤预后 许多报道发现：

肿瘤Tregs的含量增高意味着较差的预后。Curiel等首次证实肿瘤相关的CD4+CD25+ T细胞与上皮卵巢癌(epithelial ovarian cancer ,EOC)的较差临床预后相关。即在EOC的Ⅲ、Ⅳ期CD4+CD25+ T细胞的含量最高。且发现在肿瘤块中有大量的CD4+CD25+CD3+T细胞积聚,其含量在Ⅲ、Ⅳ期较Ⅰ期更高。发现其75%在靠近CD8+T细胞处，这就增加了其通过细胞间接触抑制的可能性。肿瘤内的Tregs 与存活率负相关，即使EOC已处控制阶段或外科减灭术之后，Tregs仍是一有意义的死亡预测指标。
Sato等发现CD8+T 细胞与FoxP3+CD25+Tregs之比高的EOC患者较低的患者有较长的中位存活时间，这种现象尤其见于上皮内的TIL而非间质中的TIL。

很多研究报告肿瘤中Tregs数量增加则存活或治疗反应下降。但另一些研究则认为无预测价值。如最近研究表明肿瘤中浸润的FOXP3+CD4+CD25+ T细胞并不能预测肾细胞癌的存活率。还有几项研究，尤其是恶性血液病中，表明Tregs数量增加预示预后良好。如最近一研究显示：Tregs数量增加预示滤泡淋巴瘤，部分弥散性大B细胞淋巴瘤和部分Hodgkin淋巴瘤患者预后较好[4]。

2 CD4+CD25+Tregs在肿瘤免疫治疗中的应用

以降低CD4+CD25+Tregs作用，增强对肿瘤的免疫应答为新策略的肿瘤免疫治疗探索已有初步进展，主要有以下方式。

2.1 去除CD4+CD25+Tregs

2.1.1 许多研究表明：去除CD4+CD25+Tregs可增强抗肿瘤应答，主要方法有：

使用denileukin

diftitox(又名ONTAK，白介素-2和白喉毒素的融合剂) 多家研究表明癌症患者使用denileukin diftitox可减少Tregs，增加效应性T细胞活性。皮肤T细胞白细胞/淋巴瘤的特征为大量恶性CD4+CD25+ T细胞，FDA已批准使用denileukin diftitox治疗这两种病。 因此，2005年Jens Dannull等首次从事了选择性地去除CD4+CD25+Treg的临床研究，他们用denileukin diftitox从癌症患者外周血单个核细胞(PBMCs)中选择性地去除表达CD25的Tregs，而没有诱导出对仅有中到低度水平表达CD25的其他细胞产生的毒性。denileukin diftitox显著地减少了出现在转移性肾细胞癌患者外周血中的Tregs数量，废止了Tregs调节的体内免疫抑制活动，而且去除Tregs伴用RNA转染的树突状细胞接种与只用接种比较显著提高了对肿瘤特异性的T细胞免疫反应。

使用环磷酰胺：

低剂量的环磷酞胺可以选择性清除Tregs，增强抗肿瘤免疫应答。小鼠模型中，环磷酰胺以去除Tregs并增加树突细胞接种对黑色素瘤和结肠癌疗效。

Ghiringhelli等[5]采用环磷酰胺节律化疗方案治疗化疗抵抗癌症患者可选择性地减少循环Treg,也就是与抑制了Tregs对传统T细胞和NK细胞的抑制功能有关，而这些传统的T细胞和NK细胞可导致外周T细胞扩增和初始杀伤活动恢复。认为环磷酰胺化疗方案是一减少肿瘤诱导的免疫耐受的有价值的治疗方法。

甲磺酸伊马替尼：

以临床用药浓度使用，甲磺酸伊马替尼体外可损害Tregs的免疫抑制功能和FoxP3的表达。伊马替尼可显著降低Tregs的转录因子STAT3和STAT5的激活，以伊马替尼处理鼠可降低其体内Tregs 含量并损害Tregs 的免疫抑制功能，伊马替尼可显著增强抗肿瘤免疫应答，以对抗BCR-ABL肿瘤[6]。

抗CD25抗体：

Ohmura等[7]用肿瘤特异性细胞毒T细胞过继转移合并抗CD25抗体以去除CD4+CD25+Tregs治疗荷瘤小鼠，结果肿瘤消失且未见再有生长。

使用叶酸受体4(FR4)单抗：

使用叶酸受体4单抗可特异性减少Tregs，激发荷瘤动物的效应性抗肿瘤反应[8]。

2.1.2 去除CD4+CD25+Tregs存在的问题

无效：

去除CD4+CD25+Tregs提高抗肿瘤免疫也有无效的报道。Attia等用Denileukin Diftitox并不能除去黑色素瘤患者的Tregs或使得转移性黑色素瘤退化。Tzankov等[9]采用直接针对于针对CD25的免疫毒性物LMB2给转移性黑色素瘤患者使用，可选择性地诱导出患者体内外周血和肿瘤浸润Tregs的部分减少。但未增加对瘤苗的免疫应答。认为应采用更综合性的Tregs去除法以提高转移性黑色素瘤患者的抗肿瘤应答。

非特异性局限：

由于CD25并非Tregs特有，许多激活的T细胞也表达CD25+,因此这一方法可能不能高效地去除Tregs，而且可能将Tregs和激活的T细胞均去除。也有可能由于Teff (效应性T细胞)转化为Tregs又加速Tregs数量“反跳”。因此应研发更特异性且更有效的去除Tregs的方法。

不良反应：

Thistlethwaite等[10]用白细胞分离术将6名进展型肾细胞癌患者分离白细胞，之后行化疗，即用CliniMACS细胞分选系统除去患者自体白细胞中的CD4+CD25+Treg，再将处理后的白细胞重新输入患者体内，观察化疗导致的血液系统毒性，所有患者的血细胞计数均恢复，使得平均住院时间为21 d后可以出院。但1名患者随后发展为快速进展型神经综合症，6名患者对植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)的T细胞反应增加，其中5人外周血CD4+CD25+Treg短暂下降。1患者对肿瘤相关抗原h5T4特异性扩增应答增加同时伴Tregs降到最低点。认为考虑到CD4+CD25+Tregs短暂的下降以及观察到的毒性，还需要进一步探索以提高此方法的安全性和有效性。

此外，除去CD4+CD25+Tregs也可能使之更快地再生[11]。

2.2 单克隆抗体

由于Tregs的表型不专有，很难在体内除去Tregs，许多实验研究证明还导致了严重的自体免疫性并发症。因此更合适的方法是干预Tregs的活动，使用单克隆抗体以与CD4+CD25+Tregs表面功能分子相结合，抑制其发挥功能。

2.2.1 抗-CTLA-4

抗体抗-CTLA-4抗体可抑制恶性黑色素瘤患者Tregs的活动，约有20%患者肿块减小，但与之相伴的发生了自体免疫综合症。除去Tregs和阻断CTLA-4这两个机制可在实验研究中协同作用增加B16黑色素瘤的抗肿瘤免疫功能。

联合使用抗CTLA-4抗体和抗CD25抗体可大量减少CD4+CD25+Tregs数量，从而增加抗肿瘤免疫[12]。

2.2.2 抗B7-1/

B7-2单抗Zhou等用抗B7-1/B7-2单抗以阻断B7:CD28协同共刺激途径，用于前列腺癌小鼠和MC肠腺癌小鼠，发现得起使用B7-1/B7-2单抗可显著抑制原发前列腺癌的生长和转移癌的大小，对抑制MC肠腺癌也有效。该疗法使胸腺和外周的Tregs短暂减少，体内细胞毒检测法检测到抗B7处理鼠有T抗原特异性的效应性CTL，因此短暂阻断B7-1/B7-2可改变Tregs与对癌应答T细胞的平衡，从而提升抗癌免疫疗法的疗效[13]。

2.2.3 抗-OX40抗体、

抗-CTLA4抗体、抗-GITR抗体与抗-FR4抗体合用以调节T细胞加肿瘤内注射接种CpG 单用一种单抗即可增强肿瘤内注射接种CpG的效果，可治疗淋巴瘤。尤其抗-OX40抗体、抗-CTLA4抗体可增强激活，阻断负调节[14]。合用抗-OX40抗体和环磷酰胺(CTX)可使已成形的、免疫原性较差的B16黑色素瘤退化。该组合疗法可使肿瘤内Tregs除去同时伴效应性CD8+ T 细胞浸润，从而在肿瘤内产生较有利的Teffs与Tregs之比[15]。

2.2.4 抗-GITR抗体

Shimizu等给小鼠使用抗-GITR(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体)抗体后增强了免疫应答。

2.2.5 抗体封闭OX40(CD134)途径　

COX-2 抑制剂或EP-受体拮抗剂 aTregs表达COX-2并以PGE2-cAMP 依赖的方式抑制反应性T细胞，可用COX-2 抑制剂或EP-受体拮抗剂逆转这一机制。Yaqub等[16]用COX-2 抑制剂或cAMP-拮抗剂治疗结肠癌患者可增强抗肿瘤应答，与除去Tregs的效果相当。

2.3 蛋白分子转移

Liu等[17]同时肿瘤内转移趋化因子(次级淋巴组织趋化因子， Fas配体)和协同刺激分子(4-1BBL，TRANCE)4种分子可增加肿瘤浸润的抗肿瘤细胞数量而降低肿瘤中的Tregs数量，呈现出对已成肿瘤的更强抗肿瘤反应。Yang等[18]发现Tregs较CD4+CD25- T细胞的亲凋亡蛋白Bax，因此可用Bax促进Tregs凋亡途经作为一新疗法。还可用FasL以预先除去肿瘤内的Tregs也可提高过继性T细胞转移疗法的效果。另有研究除去CD25+T细胞合并或单独体内以抗体阻断CTLA-4或GITR可增加Tregs抗肿瘤免疫中的肿瘤排斥作用。将肿瘤非敏感小鼠的脾细胞悬浊液中除去CD4+CD25+T细胞即可体外产生抗肿瘤的效应细胞。因此除去Tregs可在体内外废止对同源基因肿瘤的无反应性。这就导致肿瘤特异性和非特异性效应细胞的自发发育。对癌症早期患者Tregs可能为一重要的治疗目标。应用针对转录因子FOXP3的短链干扰RNA(siRNA)可在体内废止Tregs，有利于高效的抗肿瘤应答产生。

2.4 阻断Tregs的迁移和分化

用CCL22单抗阻断Tregs迁移到肿瘤组织中有利于肿瘤治疗。还可调控FOXP3以调节Tregs的分化,IL-4在T细胞活化时抑制FOXP3，GATA-3可抑制FOXP3的诱导，调控IL-4和GATA-3有利于免疫耐受从而有助于抗肿瘤免疫。

2.5 逆转Tregs的分化许多肿瘤相关的Tregs是抗原特异性的，可将其分化转向有用的路径，如有可能将肿瘤特异性的Tregs转为肿瘤特异性的效应T细胞。

而且去除Tregs可产生空位随后又有Tregs重新填充之。有发现普通的芳烃受体可控制Th17与Tregs的分化比例，如这样产生的Th17无害的话，芳烃受体可被开发利用以逆转Tregs的分化。

2.6 阻断Tregs的功能

表达李斯特溶血素O的大肠杆菌可在体内抑制CD4+CD25highTregs的功能。

抑制性的STAT3可降低Tregs的抑制功能。激活肿瘤Tregs的OX40 可废止其抑制功能并增强其肿瘤排斥功能[19]。CT26细胞结肠癌中的仙台病毒可抑制小鼠的Tregs功能，可能是通过诱导IL-6 产生实现的。

2.7 疫/瘤苗通过疫苗产生抗原特异性的效应细胞而限制抗原特异性的Tregs产生是较好的免疫治疗策略。实现这一策略的方法有：

CD40拮抗剂加Toll样受体激活，脂质体疫苗，表达CD137单链抗体的肿瘤细胞，以及特异性树突状细胞[20]。针对FOXP3的接种增强了对肾癌模型的肿瘤免疫。Di等[21]将自体荷瘤树突细胞接种惰性NHL患者,显著降低了患者接种后外周血或肿瘤标本中的CD4+CD25+FOXP3+Tregs ，该疗法可诱导T或B细胞应答并产生对惰性NHL患者的有益之处。Zhang等[22]证实DC/4T1+Adv-TGF-beta-R 融合瘤苗较DC/4T1+Adv-LacZ 在体内外诱导的CD4+CD25+Foxp3+ Tregs 少，使用DC/4T1+Adv-TGF-beta-R 融合瘤苗阻断了肿瘤来源的TGF-β，从而减少了Tregs的诱导，增强了抗肿瘤免疫。

2.8 将Tregs调控与其他治疗模式相组合

用denileukin diftitox将Tregs去除与提高特异性免疫的重组poxviral 疫苗组合，可提高单独用后者的抗原特异性T细胞免疫应答的效果。Tregs调控与某些能激发重要肿瘤免疫原的细胞毒性试剂相组合可能有用，相当于一种内源性接种。

2.9 提升被抑制效应细胞的阈值

最近一项研究中，抗CTLA-4抗体减少了人血中的特征表形Tregs，而血中细胞毒性的CD8细胞并没有增加。但特征表形Tregs数量很快又反弹。但反弹特征表形Tregs是否有特异性抑制功能尚未确定。树突状细胞激活的肿瘤浸润性T细胞可抵抗Tregs的抑制作用[23]。

3 小结与展望

现已可采用多种方法除去CD4+CD25+Tregs或调控其功能，以达到增强肿瘤免疫应答的效果，但除少数临床试验应用外，与 CD4+CD25+Tregs相关的肿瘤免疫疗法绝大多数尚处于起步和探索的实验阶段，其有效性和安全性方面仍有许多问题期待解决。随着对CD4+CD25+Tregs的生物学基础研究，尤其是其特异性表型认定的进一步深入，其与肿瘤免疫关系的进一步深入研究，除去CD4+CD25+Tregs或调控其功能手段的进一步细致、完善，必将开发出一套完善、成熟的与CD4+CD25+Tregs相关的肿瘤免疫疗法，并有可能在不久的将来应用于临床。

【参考文献】