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摘要：艾滋病问题越来越受到人们的关注，其严重威胁着人类的生命健康，现今使用的抗艾滋病药物都不能根治，并且不同程度的产生了耐药性，研究艾滋病的致病机理及其耐药性机制对抗艾新药或疫苗的研发具有重要的指导意义。 1981年5例艾滋病人在美国被发现，其后艾滋病就迅速蔓延，严重威胁着人类的生命健康，已引起了世界卫生组织及各国政府的广泛关注，联合国艾滋病规划署2006年5月30日宣布：自1981年6月首次确认艾滋病以来，25年间全球累计有6500万人感染艾滋病毒，其中250万人死亡。到2005年底，全球共有3860万名艾滋病病毒感染者，当年新增艾滋病病毒感染者410万人，另有280万人死于艾滋病。2007年，全球防治艾滋病的努力取得了显著进展，艾滋病流行首次呈现缓和局势，新增艾滋病毒感染者的数量以及因艾滋病死亡的人数都出现下降；不过，各国的情况并不均衡，全球艾滋病患者的总数也仍然居高不下。所以一直以来艾滋病研究也成为当今社会的热点，各学术界也对艾滋病进行了广泛的研究，它牵涉到了社会科学，自然科学，人文科学等的各个领域，如此高的关注度，对艾滋病药物的研发自然投入了巨额的资金，然而一系列的临床失败不得不使人怀疑抗艾滋病疫苗的上市至少需要10年之久，但毋庸置疑，在抗艾滋病药物的研发方面还是取得了一些进展。 （一）HIV结构与生物学特性 HIV为单链RNA病毒，直径在90-130nm之间的反转录病毒。属逆转录病毒科的慢性毒属，分为两型即HIV-1,HIV-2,通常所说的艾滋病是由1类引起的。病毒颗粒由p24蛋白构成的衣壳包裹，其内含有两条完全相同的单股RNA以及HIV复制必须的蛋白酶，逆转录酶和整合酶。衣壳外还包有一层基质蛋白p17，再往外为包膜，包膜由双层磷脂分子构成，其上有四聚体蛋白复合物，复合物的每个亚单位由gp120蛋白和gp41蛋白构成，其中gp120是膜外蛋白，gp41是跨膜蛋白。 HIV-1的基因长约9.7kb，有9个基因片段.3个基因编码结构蛋白：gag编码核心蛋白p24,p27等；env编码包膜蛋白gp120和gp41；pol编码蛋白酶，逆转录酶和整合酶。三个基因编码调节蛋白：tat能增加所有基因的表达，rev增加gag和env的基因表达；nef为推动病毒的复制。另三个基因与病毒的成熟与释放有关：vif表达病毒颗粒传染因子；vpu表达病毒蛋白u；vpr表达病毒蛋白r。 另外病毒在宿主内的生命周期在这就不再赘述。 《二》 主要抗艾滋病及HIV的耐药性 抗病毒治疗是治疗艾滋病的根本有效地方法，而抗艾药物的研发一直举步维艰，究其原因，主要是由于艾滋病毒的突变率高，基因的变种多。 抗艾滋病药的作用靶点艾滋病毒(HIV)复制过程中有三个由病毒基因编码的复制关键酶，即逆转录酶(reverse transcriptase,RT)、蛋白酶(protease,PR)及整合酶(integrase)，它们均为发展抗艾滋病毒药物的重要靶点。目前使用的抗艾滋病药物主要可分为四大类：分别是核苷类逆转录酶抑制剂，非核苷类逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂，融合抑制剂，其作用机理分别是作用于HIV生命周期的不同阶段。 核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor,NRTI)是发现最早的一类药物，核苷类逆转录酶抑制剂耐药性及耐药机制属于NRTI的抗艾滋病毒药物共有8个品种，即齐多夫定(zidovudine，AZT)、去羟肌苷(didanosine，ddI)、扎西他滨(zalcitabine，ddC)、司他夫定(stavudine，d4T)、拉米夫定(lamivudine，3TC)、阿巴卡韦(abacavir，ABC)、富马酸替诺福韦酯(tenofovir DF，TDF)、恩曲他滨(emtricitabine,FTC)。NRTIs均为DNA合成天然底物的衍生物，AZT及d4T为脱氧胸苷的类似物，ddC、3TC及FTC为脱氧胞苷的类似物，ddI及tenofovir DF为脱氧腺苷及开环脱氧腺苷酸的类似物，ABC为脱氧鸟苷的类似物，它们均需在细胞内转化为活性三磷酸或二磷酸衍生物，才能发挥抑制HIV1 RT作用。它们全部是HIV1 RT底物的竞争性抑制剂，抑制RT活性，阻碍前病毒DNA合成；并由于在结构上3′位缺乏羟基，当它们结合到前病毒DNA链的3′末端时，不能再进行5′→3′磷酸二酯键的结合,终止了病毒DNA链的延长，又为链末端终止剂。通过上述作用机制,抑制HIV复制。它们与HIV1 RT亲和力远比与细胞内正常DNA聚合酶亲和力强，因此具有一定的治疗指数。 非核苷类逆转录酶抑制剂(nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor,NNRTI)耐药性及耐药机制属于NNRTI的抗艾滋病毒药物共有3个品种［奈韦拉平(nevirapine，NEV)、地拉韦平(delavirdine，DEL)和依非韦伦(efavirenz，EFV)］。NNRTI与接近活性中心的P66亚单位疏水口袋结合，与NRTI结合位置不同，是RT的非竞争性抑制药。NNRTI易引起耐药及交叉耐药，常见引起耐药的单一取代有A98G、L100I、K101E、K103N、V106A、V108I、E138K、T139I、T181C、Y188C、G190A、F227L及P236L，以K103N最常见。单一取代显著引起空间障碍，降低NNRTI与RT的结合，如T181C对NEV敏感性降低>100倍，并有交叉耐药。EFV为第二代NNRTI，其分子结构较小，可结合耐药RT已重新排列的疏水口袋。如NEV对K103N的结合亲和力下降40倍，EFV只下降6倍，因此EFV仍对耐药株有效。体内外NEV极易产生耐药，临床单药治疗8周，100%患者可分离出耐药变株。 蛋白酶抑制药(protease inhibitor,PIs)耐药性及耐药机制HIV蛋白酶由99个氨基酸组成，其活性形式为C2对称匀二聚体(相同二个亚单位的聚合体)，属天冬氨酰蛋白酶类。HIV基因组中gag及gag/pol基因各编码一多蛋白前体(p55及p160)，它们均需病毒蛋白酶酶解加工为成熟的结构蛋白和功能蛋白(病毒酶)。如HIV1蛋白酶发生变异或酶活性受到抑制，则生成没有感染性的不成熟的病毒颗粒，说明HIV蛋白酶是病毒复制的必需酶。属于PIs的抗艾滋病毒药物共有9个药物，即沙奎那韦(saquinavir，SQV)、利托那韦(ritonavir，RTV)、茚地那韦(indinavir，IDV)、奈非那韦(nelfinavir，NFV)、安普那韦(amprenavir，APV)、kaletra(洛匹那韦lopinavir,LPV和利托那韦复合制剂)、Atazanavir sulfate(ATV)、福司安普那韦［fosamprenavir calcium(FAV)］及tipranavir(2005/06/22上市)。 HIV入胞抑制药耐药性及耐药机制HIV入胞抑制药目前只有一个品种上市，即FuzeonTM(T20，enfuvirtide)。体外可诱导T20耐药变株，基因型突变在gp41的3638残基，突变株对T20敏感性下降5～684倍；临床也分离到T20耐药变株，突变在gp41 HR1(Nterminal heptad repeat,NHR)的3645残基(Q32H/R、G36D/S、I37V、V38A/M、Q39R/H、Q40H、N42T/D/Q/H、N43D/S/K/Q、L44M、L45M、R46M、V69I)，对T20敏感性下降4～422倍。在NHR与CHR(Cterminal heptad repeat)连接处及CHR也可发生突变，位于HR2(CHR)的突变S138A伴发于43突变，使耐药性在原有基础上再增加3倍。这四类药物目前为止大概有20种已经批准上市。另外整合酶抑制剂及CCR5抑制剂是两类正在研发中的新药。
表 抗艾滋病药物及其疗法发展里程碑 年份 抗艾滋病药物及其疗法发展里程碑 1984 艾滋病毒发现 1987 第一个核苷类逆转录酶抑制剂齐多夫定 zidovudine /Retrovi 1995 第一个蛋白酶抑制剂沙奎那韦 saquinavir/ Invirase 上市 1996 第一个非核苷类逆转录酶抑制剂奈韦那平nevirap ine/V iramune 上市 1997 第一个双重核苷类逆转录酶抑制剂复合制剂拉米夫定 - 齐多夫定复合制剂 lam ivudine - zidovudine/Combivir 上市 2003 第一个融合抑制剂恩夫韦肽 enfuvirtide/ Fuzeon 上市 2006 第一个由核苷类逆转录酶抑制剂和非核苷类逆转录酶抑制剂组成的交叉类别复合制剂依法韦仑 - 替诺福韦 - 恩曲他滨复合制剂 efavirenz - tenofovir - em tricitabine /A trip la 上市 2007 第一个化学因子 c - c基序 受体 - 5拮抗剂马拉韦罗 maraviroc/ Selzentry 获准上市 2007 第一个整合酶抑制剂雷特拉韦钾 raltegravir potassium / Isentress 获得批准 另有报道称重庆前沿生物技术有限公司研发了具有自主知识产权的抗艾滋病I类新药“艾博卫泰”。I期临床试验结果情况良好，没有发现不良反应，并且其使用周期间隔长，从而降低了患者耐药性的发生几率，此外，其对其他抗艾滋病药物产生的肝病，中枢神经系统疾病等的副作用也有一定的缓解作用。进一步预测2010可正式上市。 当然不可忽略的是1996年美国洛克菲勒大学的华裔科学家何大一提出了联合应用抗病毒药物的治疗方案即高效抗逆转录病毒疗法HAART.它的应用使得艾滋病的发病率和死亡率大大降低。 HAART是一种联合用药的机制它的优点主要有减少了耐药突变所占的比率，使其更有效地抑制HIV的复制，阻止新突变的产生。长久以来，其弊端也暴露了出来，耐药性也是其无法回避的问题：在耐药突变的逐渐累积以及药物选择压力的双重作用下，最终可能导致交叉耐药。同时启示我们对耐药机制的阐明以及耐药检测方法的改进，对于指导临床将有重要意义。 对艾滋病的研究以牵涉到各个领域，利用Routh-Huritz准则、Lyapunov函数、Lasalle不变原理和波动引理,对一类HIV-1复合药物疗法数学模型的动力学行为进行了研究.基于基本再生数,得到了非感染平衡点和单重感染平衡点的局部或全局稳定及存在双重感染平衡点的充分条件.以此来研究艾滋病患者的复合药剂的选择，用药量，用药时间间隔等基本指标 如前所述阻碍抗艾滋病药物进展的原因主要有： 病毒的遗传多样性， 病毒包膜蛋白的快递变化和控制病毒的关键免疫应答机制还尚待了解。当艾滋病毒HIV感染机体后，会形成基因序列的‘准种’，这种准种间的基因异质性很大程度上提高了病毒的适应性，HIV-1基因在不同亚型之间具有高度的可变性，所以特异的HIV-1亚型可能具有不同的遗传障碍，并进而影响到抗病毒治疗后耐药替换的模式。所以对于准种的研究病毒在体内的进化历程，致病机理的探索对抗艾滋病的研发有重要的指导意义。 HIV的耐药类型： 1 诱导型耐药 在HIV感染的慢性期，HIV新感染细胞与机体清除感染细胞之间保持平衡，此时细胞数量保持相对稳定。其次感染者体内的病毒具有高度的异质性。其次HIV的RNA转录合成病毒DNA时极易出错，同时不具备修复的能力，则平均每次转录就发生一次突变，高的突变率导致了复杂多样的准种。 2 原耐药 一些HIV毒株天生就对一些抗逆转录病毒药物有耐药性，例如：HIV-2对大多数NNRTIs天然耐药。 目前对各种药物的耐药机制有了初步进展，在耐药性检测方法也日臻完善。 结论 抗艾滋病药物的展望 1 研究发现早期感染者准种的复杂程度存在着较大的差异，HIV感染机体后会受到机体免疫系统的压力，为了适应机体免疫的压力，病毒势必做出改变来适应此种压力，如此在在基因水平上就表现出了基因的变异。基因的突变往往编码人细胞免疫系统识别的特异性表位。由军事医学科学院微生物流行病研究所的关于《1例早期HIV感染者体内病毒准种的各基因片段的分析》报告了解到 ：感染者体内的HIV不同基因区域的离散率不同，也就反映了各编码蛋白所承受的来自机体的免疫压力不同。特别是gag区的基因反映出的病毒准种复杂程度要显著地高于pol,vif-vpr,及enu区基因，env蛋白基因的变异率要明显地低于gag和pol基因编码的蛋白。另外与结构蛋白相比，附属蛋白基因（vif和vpr基因）的变异率明显很低，因此在设计疫苗的过程中引入附属蛋白，或者从其变异率低的基因片段为切入点研究抗艾滋病药物不失为一种很有意义的尝试。 2 在感染艾滋病早期出现特异性CD8+CTL反应，它是控制HIV复制的重要的免疫反应。在人体内，CTL抗原表位的呈递受到HLA-I类基因产物抑制，有研究称有3个多态性位点位于我国人群HLA-I类分子限制性CTL表位。CTL对一些 小分子的蛋白变异高度敏感，单个氨基酸的改变都会破坏TCR对抗原表位的识别，引起CTL的失效，这种免疫压力的丧失会引起毒株的大量生长。因此研究克服以上机制或使HIV-1逃离早期的CTL反应的机制，对于研究有效疫苗有重要的参考价值。 3 以往的研究重点是关注血液系统，其缺点是不能全面的认识艾滋病毒的治病机理。然而在07年7月有法国多家科研机构组成的研究小组宣布：肠淋巴结是艾滋病毒在机体内的藏身之所。长期以来的临床发现接受强化治疗的艾滋病患者在停药治疗后，身体内很快监测到艾滋病毒，究其原因，研究猜测，在人体内，可能存在艾滋病毒的藏身之所，而且机体的免疫系统难以对其清除，大量实验发现肠淋巴结为其提供了一个良好的屏障，一种叫T-GF-B的因子导致了肠淋巴结淋巴细胞的功能损失，抑制了其活性，导致其早衰。然而他们的发现是否为我们战胜艾滋病提供了一个新的思路？比如说抑制T-GF-B细胞因子，修复功能受损的T-CD8淋巴细胞，以及加强对肠淋巴结的治疗等。但是要想利用这一发现来研究疫苗或治疗药物还将有漫长的路要走。 4 HIV-1蛋白MA在HIV-1生命周期中的侵入，融合核运输及组装等环节中起着十分主要的调节作用。其结构中的N末端核定位信号区NLS是介导整合前复合体PIC的核运输所必须的。MA在HIV-1复制中起的关键作用及核定位信号区的高度保守性，使其成为寻找新的作用机制和不易产生耐药性的抗艾滋病药物的新靶点。 5利用RNAi技术对HIV-1 vif基因的转录后水平进行下调,达到抑制vif蛋白表达的目的,为新的抗HIV治疗和预防研究提供理论基础。具体方法通过体外转录法合成siRNA,与转接有vif基因的表达质粒共同转染HEK293T细胞,荧光显微镜下观察干扰效果,并利用Real-time PCR和Western blot对HIV-1 vif分别从转录和表达水平进行验证。结果将pEGFP-N1-vif重组载体转染HEK 293T细胞后,结果显示vif蛋白可以在细胞中高水平表达;针对vif设计的3段特异的siRNA可以有效且特异地降低vif蛋白的表达。结论RNAi技术可以下调HIV-1蛋白的表达,此技术可以作为一项新的治疗和预防HIV-1的方法用于进一步的研究。 6 HIV整合酶可催化病毒复制周期中的整合过程,即将HIV反转录产物cDNA整合入宿主基因组,它是病毒复制过程不可缺少的酶。抑制该酶活性将能有效抗HIV,迄今尚未在人体内发现整合酶的功能类似物,故整合酶成为抗HIV的理想靶点。对整合酶的结构、催化活性及影响因素、整合酶抑制剂的研究将促进抗艾滋病新药的进展。 |