新疆自治区临床药学研究所  徐建国 等 摘要：从新疆野生蘑菇中提取酪氨酸酶，建立用于研究治疗白癜风药物的酶分析法。考察驱虫斑鸠菊注射液对该酶活性的影响，并与国内目前治疗白癜风病的常用药物进行对照。结果：驱虫斑鸠菊注射液对酪氨酸酶有明显的激活作用，且对酶的激活作用是所有受试药物中最强者。 白癜风（Viuligo）是常见的局限性色素减退性皮肤病「1」「2」，由于病因复杂难以治愈。我们采用新疆维吾尔医治疗白癜风的一味草药——驱虫斑鸠菊，研制成注射液剂，经多年临床使用证明是治疗白癜风的较理想药物「3」「4」。我们自行设计并建立酪氨酸酶分析法，用以对驱虫斑鸠菊注射液的作用机理进行研究与探讨。 实 验 部 分 「仪器」UV-365分光光度计（日本本岛津）；低温高速离心机（吉林离心机厂）；组织捣碎机（上海医疗器械厂） 「仪器」DL-多巴（美国Sigma公司）；驱虫斑鸠菊注射液（安徽金太阳生化药业提供）；野生蘑菇（Agaricus SP.产于新疆博斯腾湖边的芦苇丛中） 「方法与结果」 一、酪氨酸酶的制备「5」 以野生蘑菇为原料，用盐析和透析的方法，提取制备酪氨酸酶。 二、酪氨酸酶的活力测定法 往盛有一定量磷酸缓冲液（PH7）的试管中分别加入0.5ml多巴水溶液(1.044mg/ml)和0.05ml酪氨酸酶溶液（总蛋白含量为1.79 mg/ ml）。37℃温育5分钟,立即用分光光度计在475nm处测定吸收率（A）。以每分钟A475增加0.001定为1个酶活力单位「6」。 本文所使用的酪氨酸酶溶液的活力单位控制在1200单位/毫升±10%。 三、各种药物对酪氨酸酶活性的影响 选用治疗白癜风的常用药物（补骨脂、白灵片、白灵酊、白疾黎、白芷和白癜净）；微量元素（铜和锶）；驱虫斑鸠菊注射液和生理盐水，观察各种药对酶活性的影响。为实验方便，将部分药物作如下处理： 1、分别将补骨脂、白灵片、白疾黎和白芷粉碎，用90%乙醇侵泡提取，提取液置水浴上挥尽乙醇，加入适量水，过滤，滤液备用。 2、往一定量的白灵酊和白癜净中加入适量水，在水浴上挥尽乙醇，过滤，滤液备用。 3、配制含铜离子20ppm的氯化铜水溶液和含锶离子200ppm氯化锶水溶液。 在酶促反应中分别加入以上各种药物，测定酶活力值，并且计算活力增加百分率。结果见表1，绘制药水物对酪氨活性的影响曲线（图1）。 四、药物提高酪氨酸酶活性的动力学观察 选用对酪氨酸酶活性有提高作用的驱虫斑鸠菊注射液、补骨脂、白灵酊和铜离子水溶液。按酶活力测定方法操作，试剂用量与结果见表2。以吸收率的倒数（1/A）对底物浓度的倒数（1/S）作Linewaver--Burk曲线「7」（图2）。用米氏公式计算出Km和各自的Km值「8」，将各回归方程的斜率值（h）进行显著性检验（表3） 结论与讨论  铜离子、补骨脂、白灵酊和驱虫斑鸠菊注射液均能提高酪氨酸酶的活性。锶离子、白灵片、白芷、白疾黎、白癜净和生理盐水则无此作用      表1  药物对酪氨酸酶活性影响表                                                           NO        药物        用量 ml      A475nm±SD       酶激活率（%）                                                                                                                   铜离子水溶液       0          0.332±0.006 1   （Cucl2           0.2        0.370±0.009       11.11               20ppm)            0.4        0.382±0.002       14.71                                 0.6        0.397±0.009       19.21                                 0.8        0.407±0.004       22.22                补骨脂           0          0.416±0.005 2    （相当于原生        0.2        0.489±0.008       17.5              药约50mg/          0.4        0.526±0.015       26.44              ml)                0.6        0.528±0.017      26.92                                 0.8        0.530±0.008       27.4               白灵酊            0          0.352±0.001            （与原药为1          0.2        0.353±0.006       0.28 3    ：1体积比）         0.4        0.372±0.011       5.68                                 0.6        0.426±0.014       21.02                                 0.8        0.438±0.012       24.43             驱虫斑鸠菊注        0          0.384±0.005 4    射液(相当于         0.2        0.434±0.028       13.02             原生药50mg          0.4        0.548±0.041       42.71             /ml)                0.6        0.630±0.007       64.06                                 0.8        0.665±0.013      73.18                 注：（1）锶离子、白灵片、白芷、白疾黎、白癜净和生理盐水对酪氨酸酶无激活作用，所以未列入此表。    （2）酶激活百分率计算方法： 不加入药物时所测得的A475记为A1，加入药物后所测得的A475记为A2。 酶激活百分率=（A2—A1）/A1*100%         表2  各种药物对酪氨酸酶活性影响的动力学测定结果                                   药物    多巴（ml）    A475±SD    1/多巴（1/ ml）1/ A475  回归方程       Km or K´ 铜离子水    0.2          0.118±0.008        5.00  8.474   1/A=1.769*1   0.9097*10-3 溶液          0.3          0.145±0.002       3.33  6.896       /s+1.596 (g/ml)   （CuCl2）    0.4          0.175±0.007       2.50  5.741       r=0.9839 20ppm        0.5          0.192±0.014         2.00  5.208          (0.5ml)       0.6          0.207±0.005         1.67  4.831                          0.7          0.239±0.004         1.43  4.184                          0.8          0.279±0.009         1.25  3.584                          0.9          0.295±0.006         1.11  3.390                           1.0          0.317±0.027         1.00  3.154          补 骨 脂    0.2          0.274±0.005       5.00  3.650       1/A=0.741*1  0.3356*10-3 （相当原       0.3          0.228±0.009       3.33  3.550       /s+1.506  (g/ml) 生药          0.4          0.301±0.016       2.50  3.322       r=0.9662 50mgml)      0.5          0.317±0.012         2.00  3.155          (0.5ml)       0.6          0.379±0.004         1.67  2.639                          0.7          0.402±0.002         1.43  2.488                          0.8          0.410±0.001         1.25  2.439                          0.9          0.415±0.007         1.11  2.409                           1.0          0.421±0.005         1.00  2.375          白 灵 酊     0.2          0.201±0.008      5.00  4.975       1/A=0.759*1  0.3900*10-3 （与原药       0.3          0.228±0.009       3.33  4.386       /s+1.999  (g/ml) 为1：1体    0.4          0.243±0.001       2.50  4.115        r=0.9800 积 比）        0.5           0.271±0.004       2.00  3.690          （0.5ml)      0.6          0.307±0.001       1.67  3.257                          0.7          0.307±0.001         1.43  3.257                          0.8          0.338±0.002         1.25  2.959                          0.9          0.355±0.005         1.11  2.817                           1.0          0.376±0.004         1.00  2.660          驱虫斑鸠       0.2          0.293±0.002       5.00  3.413       1/A=0.472*1  0.2912*10-3 菊注射液       0.3          0.320±0.009       3.33  3.125       /s+1.644  (g/ml) （相当原       0.4          0.353±0.027       2.50  2.833       r=0.9806 生物            0.5          0.392±0.013       2.00  2.551          50mg/          0.6          0.409±0.004         1.67  2.445          ml）0.5ml      0.7          0.421±0.005       1.43  2.375                          0.8          0.457±0.001         1.25  2.188                          0.9          0.464±0.003         1.11  2.155                           1.0          0.479±0.007         1.00  2.088          未加任何       0.2          0.110±0.004        5.00  9.091       1/A=1.900*1  1.1197*10-3 药（酪氨       0.3          0.123±0.003       3.33  8.130       /s+1.721  (g/ml) 酸酶的米       0.4          0.157±0.001       2.50  6.369       r=0.9972 氏常数测       0.5          0.186±0.010       2.00  5.376          定）            0.6          0.202±0.005       1.67  4.950                          0.7          0.216±0.005         1.43  4.630               0.8          0.245±0.010         1.25  4.082                          0.9          0.271±0.015         1.11  3.690                                1.0          0.286±0.013         1.00  3.496                                                                                        表3  各回归方程斜率值（b）显著性检验（t检验）结果 1           b          b1         b2         b3         b4            b5 b                    (1.769)            (0.741)     (0.759)     (0.472)      (1.900) b1                                        (1.769)                 0                         b2                    ***                       (0.741)               4.780         0                   b3                    ***          △                  (0.759)                6.161         0.153        0              b4                    ***          **          ***            (0.472)                9.628         3.824       4.346        0    b5                     *            ***         ***        ***  (1.900)                2.193         16.578        12.634     22.623         0           “***”：表示P＜0.001 “**”：表示P＜0.01 “*”：表示P＜0.05 “△”：表示P＞0.05                    补骨脂用量超过0.4 ml,酶的活性基本不再增加,趋与平稳，提示补骨脂对酶的激活作用具有饱和性。补骨脂、白灵酊和铜离子对酶激活作用的量效关系远不如驱虫斑鸠菊注射液明显。 各动力学回归方程的斜率值（b）的显著性检验结果提示驱虫斑鸠菊注射液参与酶促反应所得b值与原酶促反应之b值差异最显著，说明驱虫斑鸠菊注射液对酶活力影响最显著。各药作用的强弱顺序为驱虫斑鸠菊注射液＞补骨脂＞白灵酊＞铜离子。 比较表2中的米氏常数Km和有驱虫斑鸠菊注射液参与反应测得的K`m值（Km/ K´m =1.1197*10－3/0.2912*10－3约等于4）,驱虫斑鸠菊注射液可提高酪氨酸酶与底物的亲和力约4倍,有极明显的酶激活作用.其激活酶的方式为竞争性的(图2)。人体内黑色素的生物合成过程可简单表示为: 酪氨酸酶 酪氨酸----→多巴----→多巴醌----→黑色素「9」「10」             慢         快 酪氨酸酶参与色素的形成过程,酶的活性直接关系到黑色素和生成速度与数量.酪氨酸酶为含铜酶「11」,铜是该酶的活性中心,我们研究结果提示驱虫斑鸠菊注射液通过其中的驱虫斑鸠菊和微量金属元素铜的双重作用,提高酪氨酸酶的活性,使黑色素的生成增加,恢复白斑处的皮肤面色,达到治疗白癜风病的目的.驱虫斑鸠菊注射液含有微量金属元素铜（含铜8.7±2.5ppm）[12] ,实验证明驱虫斑鸠菊注射液对酶激活作用大于铜离子,因此,驱虫斑鸠菊中何种成分起主要的酶促作用是值得深入研究的课题. 致谢：本文原稿曾由新疆医学院刘发教授和新疆自治区人民医院石得仁主任医师审阅，特表感谢！ 参考文献   [1]李长海等，武汉医学杂志,1984；8（2）：108-109 [2] Aaron B, Lerner MD, James J, Nordlund, MD: Vitihgo. 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