新生血管的生成和经Raf/MEK/ERK级联的信号传导在肝细胞癌(HCC)进展中发挥着重要作用。因此,抑制新生血管生成及Raf/MEK/ERK可能是治疗HCC的有效方法。索拉非尼是一种多激酶抑制剂,该药可通过抑制丝/苏氨酸激酶和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、FLT3、Ret和c-Kit 的受体酪氨酸激酶,阻断肿瘤细胞的增殖和血管的形成。[Cancer Res 2006, 66(24): 11851]
索拉非尼抑制HCC细胞系增殖并诱导凋亡
为探讨索拉非尼对PLC/PRF/5和HepG2肝癌细胞株的体外作用,美国拜耳医药保健有限公司肿瘤生物学部Liu等将索拉非尼溶液加入两种肿瘤细胞培养板中共同孵育,直接观察HCC细胞受抑制的程度。
结果表明,索拉非尼抑制细胞增殖和加强TUNEL染色的作用均呈剂量依赖性,且可诱导两种HCC细胞系均出现DNA断裂。在索拉非尼处理后48小时,两种HCC细胞系中均发现核固缩和核碎裂,这正是细胞凋亡的特征,但在PLC/PRF/5细胞中表现为核固缩和核碎裂,而在HepG2细胞中以核固缩为主。
用流式细胞仪对细胞周期进行分析可知,HepG2细胞在经索拉非尼处理24h后G1期缩短而S期延长,而PLC/PRF/5细胞的细胞周期受索拉非尼的影响较少。
索拉非尼抑制HCC细胞系的Raf/MEK/ERK信号传导通路
Raf激酶是MEK/ERK级联通路中的关键调节酶,在HCC中它通过Raf/MEK/ERK通路上调信号传导而发挥重要作用。在未经刺激和经肝细胞生长因子刺激的细胞中,索拉非尼使PLC/PRF/5细胞的MEK和ERK磷酸化受抑制的浓度范围为3~10 μmol/L(图1A),而使HepG2细胞受抑制的浓度范围为1~3 μmol/L(图1B)。
细胞周期素(cyclin)D1是与细胞增殖有关的一种蛋白,在肿瘤细胞中通过Raf/MEK/ERK和磷脂酰肌醇-3激酶通路活化。索拉非尼浓度达10 μmol/L时,两种细胞中的cyclin D1蛋白水平均有所降低(图1)。
图1 索拉非尼抑制PLC/PRF/5细胞和HepG2细胞的Ref/MEK/ERK信号通路,并使HCC细胞中cyclin D1水平下调
索拉非尼下调HCC细胞eIF4E磷酸化水平及Mcl-1水平不依赖MEK/ERK信号传导通路Mcl-1是Bcl-2家族的一种抗凋亡蛋白,也是HCC中目前已知的重要抗凋亡因子。本研究结果发现,用1 μmol/L 和10 μmol/L浓度的索拉非尼处理2小时之后,两种HCC细胞系内的eIF4E磷酸化水平均下降。在10 μmol/L浓度下处理16小时之后,Mcl-1蛋白水平也有下降。而在相同的条件下,MEK抑制剂U-0126对HepG2细胞的eIF4E磷酸化水平或Mcl-1蛋白水平均无影响。这表明,索拉非尼能降低eIF4E的磷酸化水平并下调Mcl-1的表达,且该效应并不依赖于其对MEK/ERK通路的作用。
索拉非尼对PLC/PRF/5人HCC异种移植瘤体内抑瘤效应及机制
研究者还收集对数生长期的PLC/PRF/5细胞,对CB17 SCID雌性小鼠行肿瘤异种移植试验。当所有小鼠的肿瘤长到140~160 mg时开始给它们每天灌喂1次甲苯磺酸索拉非尼(10、30或100 mg/kg,连用16或21天),然后评价索拉非尼的抗肿瘤疗效。
在SCID小鼠中,甲苯磺酸索拉非尼对皮下植入的PLC/PRF/5异种移植瘤的生长抑制作用呈剂量依赖性。10 mg/kg和30 mg/kg的索拉非尼对肿瘤的抑制程度分别为49%和78%(P<0.001,图2A)。在100 mg/kg剂量下,索拉非尼对肿瘤的抑制作用更强(图2B),50%的小鼠体内获得持久的肿瘤部分消退效应。
图2 索拉非尼对小鼠体内的PLC/PRF/5 HCC肿瘤具有显著的抑瘤效应(*P<0.001)
研究者对肿瘤达200~300 mg的SCID雌鼠进行连续5天的甲苯磺酸索拉非尼灌服,每天1次,剂量为30 mg/kg或100 mg/kg。最后一次给药后3小时取出肿瘤,对肿瘤组织进行免疫组化染色。结果表明,30 mg/kg和100 mg/kg的甲苯磺酸索拉非尼均能显著降低PLC/PRF/5异种移植瘤微血管面积百分比(MVA)(P<0.001),且均能降低ERK磷酸化水平,并诱导细胞凋亡。在PLC/PRF/5异种移植瘤中所观察到的索拉非尼对磷酸化ERK和磷酸化eIF4E水平的降低作用及细胞凋亡的诱导作用,与其在HCC肿瘤细胞凋亡中的直接作用及其已知的对肿瘤微血管的抗血管生成作用相一致。
讨 论
Raf激酶在大多数HCC患者的肿瘤组织中均过度表达,HBV和HCV及有丝分裂生长因子均能激活Raf/MEK/ERK途径。现有研究资料表明,索拉非尼能抑制PLC/PRF/5和HepG2细胞中的Raf激酶,进而阻断MEK/ERK信号传导途径,并可降低这两种细胞系的cyclin D1水平,从而抑制细胞增殖。此外,索拉非尼还能诱导细胞凋亡,PLC/PRF/5和HepG2细胞中观察到的DNA断裂及TUNEL染色、核碎裂和核固缩的增加等结果均提示这一结论。
尽管索拉非尼对细胞周期的调节作用在不同HCC细胞系中有所不同,但它在两种细胞系中均能使抗凋亡蛋白Mcl-1表达下调,并降低eIF4E的磷酸化水平。仅采用索拉非尼治疗5天即可显著抑制PLC/PRF/5肿瘤的血管生长、降低ERK和eIF4E的磷酸化水平并诱导细胞凋亡。这可能与索拉非尼通过Raf激酶依赖性和Raf激酶非依赖性途径发挥其抗血管生成活性、抑制肿瘤细胞信号传导活性并诱导细胞凋亡有关。
总之,作为一种多激酶抑制剂,索拉非尼对Ser/Thr激酶Raf及多种受体酪氨酸激酶均有抑制作用。索拉非尼在体外和体内均能抑制Raf/MEK/ERK信号传导通路,在体内抑制肿瘤血管生成并诱导肿瘤细胞凋亡,并且在SCID小鼠人类HCC模型中具有明显疗效。除了明显的抗血管效应外,索拉非尼也可能通过抑制Raf/MEK/ERK信号传导通路、降低eIF4E磷酸化水平,并下调Mcl-1蛋白表达水平,从而诱导HCC细胞凋亡。
(参考文献从略)
来源：多吉美
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