乳腺癌是目前危害妇女生命最常见的肿瘤，化疗是目前临床上治疗乳腺癌的主要手段之一。但是，在临床上肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药性（multidrug resistance，MDR）往往导致化疗失败。MDR是指肿瘤细胞能对多种化学结构、功能和作用机制均不同的抗癌药物产生交叉抗药性。易引起典型MDR的药物一般是天然来源和疏水性药物，如阿霉素（adriamycin，ADM）和长春花生物碱，也包括一些合成药物，如米托蒽醌。ADM是临床上广泛使用的一种抗肿瘤化疗药物，是乳腺癌化疗的一线药物，为蒽环类抗生素，可以嵌入DNA的两个相邻碱基对，与其双螺旋结构形成复合物，抑制与DNA复制及转录聚合酶和DNA依赖性的RNA聚合酶，影响DNA和RNA的合成，因此ADM对S期细胞最敏感，M期细胞次之。

研究结果表明，克服肿瘤耐药性的主要途径有:（1）应用MDR调节剂，逆转多药耐药性;（2）提高药物剂量强度，如大剂量化疗;（3）应用解救化疗方案，换用其他无交叉耐药性的药物。体外实验中，业已证实能逆转多药耐药性的药物包括:钙通道阻断剂（如异搏定）、调钙素抑制剂（如酚噻嗪）、免疫调节剂（如环孢素-A）、奎尼丁类及细胞因子（如肿瘤坏死因子）等 ［1，2］ 。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）是一种具有多种生物学功能的细胞因子，是迄今为止所发现的杀伤力最强的抗肿瘤细胞因子，可以特异性地引起肿瘤细胞坏死，并可逆转肿瘤细胞的MDR，增加化疗敏感性 ［3］ ，近年来有报道，肿瘤坏死因子可以在基因、蛋白及细胞水平上逆转肿瘤细胞的耐药性，增加产生多药耐药性的药物对癌细胞的毒性，克服多药耐药表型 ［4］ 。但是全身大剂量应用人TNF-α可产生严重的毒副作用，而小剂量又难以达到治疗效果，限制了其在临床上的应用。因此，国内外许多学者通过改变TNF-α的结构寻找高效、低毒的TNF突变体，并取得较大进展。2003年4月中国SFDA批准上市的国家一类新药—重组改构人肿瘤坏死因子（recombinant mutant human tumor necrosis factorpalpha，rmhTNF）即是应用蛋白质工程技术改造天然TNF-α而制成的高活性、低毒性的基因工程TNF-α。最近有研究发现rmhTNF能够有效提高对ADM不敏感的人大肠癌肿瘤细胞对ADM的敏感性。本研究旨在探讨体外rmhTNF在人乳腺癌细胞中与ADM联合使用时的协同作用，和逆转多药耐药性人乳腺癌细胞对ADM的耐药性，并初步探讨二者联合使用时的用药顺序，为临床用药提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与细胞培养 MCF-7细胞株及MCF-7/Adr细胞株均为人乳腺癌细胞株，前者来源于乳腺癌患者的胸腔积液（白人成年女性），后者是前者接触浓度递增的阿霉素诱导而成的耐药株，同时对多种化疗药物具有交叉耐药性，即具有多药耐药性（MDR）。以上两株细胞来源于复旦大学附属肿瘤医院中心实验室。在5%CO 2 、37℃环境中培养，细胞培养液为DMEM，并加入了10%的小牛血清。

1.2 实验材料及主要试剂 重组改构人肿瘤坏死因子（rmhTNF）由上海赛达生物药业有限公司提供，比活性为2.5×10 5 U/μl。阿霉素（ADM）购于浙江海正药业公司。DMEM及小牛血清为美国Hyclone公司产品。酶联免疫测定仪为澳大利亚BIO-TEK公司产品。CCK-8为日本同仁化学研究所Dojindo Laboratories产品，该试剂中含有WST-8即2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪嗡硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲 月赞染料，生成的甲 月赞 物的数量与活细胞的数量成正比。

1.3 细胞毒性分析 取对数生长期乳腺癌细胞，常规消化成2×10 4 /ml的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔100μl DMEM细胞培养液。5%CO 2 、37℃环境中培养24h后分别加入5组药物:第1组加入不同浓度ADM，培养48h;第2组加入不同浓度rmhTNF，培养48h;第3组加入不同浓度ADM，培养24h后去除含有ADM的培养液，再加入一定浓度rmhTNF（500U/ml），培养24h;第4组加入一定浓度ADM（2μg/ml）或泰素（taxol，浓度为20nM），培养24h后去除含有ADM或taxol的培养液，再加入不同浓度rmhTNF，培养24h;第5组同时加入不同浓度rmhTNF及一定浓度ADM（2μg/ml），培养48h。检测时，每孔细胞中加入5μl的CCK-8试剂，5%CO 2、37℃环境中培养2h后，在酶标仪上波长450nm处读取光密度A值，计算细胞存活率（cell survival rate，CSR）。

细胞存活率（CSR）=试验组A值对照组A值×100%

1.4 统计学方法 所有数据均以均数表示，采用t检验。

2 结果

2.1 MCF-7/Adr对ADM处理不敏感 MCF-7/Adr细胞 是一株源于人乳腺癌细胞株MCF-7细胞的多药耐药性的乳腺癌细胞，研究证明它对包括ADM在内的多种化疗药物不敏感。在本研究中我们用各种不同浓度的ADM（1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，6μg/ml及8μg/ml）分别处理MCF-7细胞和MCF-7/Adr细胞，48h后用CCK-8法测定细胞的存活率，其结果如图1所示:耐药性MCF-7/Adr细胞对所有浓度的ADM处理均无反应，细胞存活率维持在100%左右，而亲代株MCF-7细胞的存活率却随着ADM浓度的增加明显下降，当ADM浓度为8μg/ml时，其细胞存活率不足50%。这个结果确认了ADM对亲代MCF-7细胞的毒性作用和多药耐药性株MCF-7/Adr细胞对ADM的不敏感性。

2.2 rmhTNF逆转MCF-7/Adr细胞对ADM的耐药性 在临床上对化疗药物产生耐药性是目前肿瘤治疗中的一大难题。在这个研究中，我们对耐药性株MCF-7/Adr细胞在第一天用ADM（6μg/ml）处理后，在第二天用新近上市的国家一类新药重组改构人肿瘤坏死因子（rmhTNF）（500U/ml）处理，结果如图2a所示。发现耐药株MCF-7/Adr细胞从原本2天单用ADM（6μg/ml）的91.80%细胞存活率，下降至67.37%细胞存活率，其敏感性上升了24.43%，而且其药物处理后的敏感性同其亲代敏感株MCF-7细胞对ADM的敏感性（细胞存活率为67.79%）相差无几（图2a）。这个结果证明了ADM处理后再用rmhTNF，能逆转多药耐药株MCF-7/Adr细胞对化疗药物ADM的不敏感性。