陈大富1　赵扬冰2　白绍槐3　史宗道4　张　杰5
  1.广州市海军医院普外科(广州510318);2.四川大学华西医院普外科;3.四川大学实验动物中心;4.四川大学华西临床医学院临床流行病学教研室;5.四川大学华西医院病理科 

【摘要】目的：探讨人参皂苷Rg3(Rg3)抑制裸鼠原位种植人乳腺浸润性导管癌的作用及其机制。方法：采用移植人乳腺浸润性导管癌的雌性裸鼠15只，随机分为Rg3组、环磷酰胺(CTX)组和对照组，分别用Rg3、CTX及对照剂连续灌胃56d，处死后病理标本用光镜及免疫组化检查。结果：Rg3组瘤重(0.84±0.26g)低于对照组(1.20±0.24g，P=0.05) ，CTX组瘤重(0.75±0.23g)明显低于对照组(P<0.05)。免疫组化显示，Rg3组的微血管密度(16.68±8.00)及血管内皮生长因子(VEGF)明显低于对照组(P<0.05)。
结论：Rg3抑制人乳腺浸润性导管癌移植瘤生长的机制可能与抑制其新生血管形成有关。
【关键词】人参皂苷Rg3　   人乳浸润性导管癌    微血管密度　
血管内皮生长因子　新生血管
【中图分类号】　R73.36

Effect of Ginsenoside Rg3 on the Progression of Orthotopically Xenotransplanted Human Breast Cancer in Nude Mice and Its Mechanism
Chen Da fu，ZhaoYangbing， Bai Shaohuai， Shi Zongdao， Zhang Jie.
Department of General Surgery，The 421th Navy Central Hospital of PLA，Guangzhou 510318，China
【Abstract】　Objective　To explore the inhibiting effect of ginsenoside Rg3 on the growth and angiogenesis of orthotopically xenotransplanted human breast infiltrating duct carcinoma in nude mice.Methods　A total of 15 female nude mice having received xenotransplanted human breast infiltrating duct carcinoma were randomly divided into 3 groups.Ginsenoside Rg3 (5mg/kg，qd)，cyclophosphamid (26mg/kg，qod) and control solution(0.5% sodium Carboxymethyl cellulose，qd)were given to each group by gas-trogavage in 0.5 ml volume for 56 days. Breast cancer masses were collected for light microscope observation.The intra-tumoral microvessel density(MVD)and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF)were examined by immunohistochemical staining. Results　The tumor weight of CTX group was significantly lower than that of control group(P<0.05)，and the comparison between those of Rg3 group and control group was nearly reaching significant level.The MVD and VEGF of Rg3 group by immunohistochemical staining were significantly lower than those of control group(P<0.05). Conclusion　 Rg3 could inhibit the growth and angiogenesis of xenotransplanted human breast infiltrating duct carcinoma in nude mice.
【Key words】Ginsenoside Rg3;　Human breast in filtrating duct carcinoma;　Microvessel density; Vascular endothelial growth factor; Angiogenesis

乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，其中多数为乳腺浸润性导管癌，约半数患者因乳腺癌转移而死亡[1]。研究证明:乳腺癌的生长和转移是新生血管依赖性的[2] ，体积超过1mm3～2mm3的肿瘤不仅需要新生血管维持营养供给和排泄代谢产物，还需要提供有利于转移的通道，才能生长和转移。抑制新生血管的生成可使肿瘤细胞进入休眠状态并诱导凋亡[3]。人参皂苷Rg3是人参中的重要成分，在体内具有明显的抑瘤作用[4]。我们应用Rg3对移植人乳腺浸润性导管癌裸鼠进行治疗，以环磷酰胺为阳性对照，观察其对肿瘤新生血管形成的影响。

1　材料和方法
1.1　材料 Rg3粉剂由吉林亚泰制药有限公司提供，纯度为99.5%。环磷酰胺(CTX，天津金世制药有限公司，批号20000601）碾磨成粉剂，均制成0.5%羧甲基纤维素钠混悬液。裸鼠人乳腺浸润性导管癌癌株F33及裸鼠(BALB/C-nu/nu)由四川大学华西医学实验动物中心[5]提供，雌性鼠15只，鼠龄4～6周，体重20～25g，饲养于SPF环境中。
1.2方法
1.2.1　动物分组及处理　将F33代人乳腺浸润性导管癌癌株切成大小为4mm3瘤块，接种于裸鼠右腋乳垫下，将15只鼠随机分为Rg3组、环磷酰胺(CTX)组及对照组，每组5只，灌胃给药均为0.5ml/只，按文献[4]的剂量和方法，Rg3组每次给Rg3 5mg/kg(人正常剂量的10倍)、CTX组每次给CTX26mg/kg(人正常剂量的26倍) ，对照组合0.5%羧甲基纤维素钠溶液。自接种次日起对照组及Rg3组每日一次，CTX组隔日灌胃一次，每周称取裸鼠体重并测量瘤体大小，持续喂养56d，完整取出瘤块，比较各组瘤重，肿瘤抑制率按以下公式计算： 
            
肿瘤抑制率=  (对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/ 对照组平均瘤重×100%

1.2.2　免疫组化检测　采用ABC法染色，标本经甲醛固定后，行5μm连续切片，将石蜡切片脱蜡至水，高压煮沸抗原修复3min，1∶20正常羊血清封闭30min，滴加1∶200血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体(鼠单克隆IgG20抗体，北京中山生物技术有限公司，批号F3520)及鼠抗人体第因子相关抗原体(武汉博士德生物技术公司，批号7269)，4℃过液，滴加1∶200生物素标记的羊抗兔IgG，37℃孵育30min，滴加1∶200辣根过氧化物酶标记的链卵合素，37℃孵育30min，DAB显色5min，以PBS代替—抗作为空白对照，以血管瘤为阳性对照。VEGF评定标准:由不知道实验分组的医师按以下标准评分:镜下胞浆内有棕黄色颗粒者为VEGF阳性染色，胞浆内未见棕黄色颗粒为阴性，以(-)表示，有少许浅棕黄色为弱阳性，以(+)表示，有较多棕黄色颗粒为阳性，以(++)表示，胞浆着色呈深黄色为强阳性。以(+++)表示。微血管密度(MVD)的判定标准参照文献[6]：在低倍视野下选择癌巢间质血管最多的视野，在200倍视野下，由3位不知道实验分组的观察者分别计数3个视野，取3人计数的平均值作为该例的MVD。1.2.3　统计学方法　对瘤体重量及微血管密度用t检验进行组间比较，对VEGF评分资料用秩和检验进行组间比较，P<0.05有统计学意义。

2　结果
2.1　 Rg3对乳腺浸润性导管癌的抑制作用 见表1。所有种植乳腺癌癌株均有生长，但生长速度不同。Rg3组肿瘤平均重量较对照组轻(P=0.05)。CTX组平均瘤重明显较对照组轻(P<0.05)。Rg3组与CTX组抑瘤率分别为30%和37.5%。
表1　各实验组瘤重(g)及MVD值
Table1 　Results of tumor weight and microvessel density in three groups
GroupTumor weight(g)MVD
Rg30.84±0.2616.68±8.00*
CTX0.75±0.23*26.30±5.83
Control1.20±0.2430.36±6.25

*P<0.05，compared with control group

图1　对照组MVD(↑增生的毛细血管)。免疫组化SP法×200
Fig 1  MVD in the control group(↑Aangiogenesis)SP×200

图2  Rg3组MVD(↑增生的毛细血管)。免疫组化SP法　×200
Fig2　MVD in the Rg3 group(↑Angiogenesis).SP　×200
2.2　 Rg3对肿瘤血管形成的影响 由表1可见，Rg3组MVD值明显低于对照组(P<0.05)，亦低于CTX组，但未达到统计学显著水平(P>0.05)。由图1、2可见，对照组毛细血管大量增生，肿瘤组织内微血管分布不均，形态不规则，呈异质性，并且毛细血管增生富集在肿瘤边缘处。Rg3组可见癌巢间质有极少量新生毛细血管。
2.3　Rg3对肿瘤VEGF蛋白表达的影响  见表2。将VEGF结果转换为等级资料：(-)=0，(+)=1，(++)=2，(+++)=3，进行秩和检验，结果显示：与对照组相比，Rg3能显著抑制VEGF蛋白表达(P<0.05)，其余各组间差异无统计学意义。
表2　各组乳癌组织VEGF蛋白表达免疫组化结果比较
Table2　Comparison of expression of VEGF in group
GroupnVEGF
(-)(+)(++)(+++)
Control5122
CTX5311
Rg35311

3  讨论
乳腺癌的生长和转移依赖丰富的血管形成，新生血管的形成过程分为毛细血管基底膜局部降解、血管内皮细胞迁移并伴随着细胞的增殖和内皮细胞形成新的毛细血管三个步骤。阻断其中任何一步，都将阻止肿瘤血管生成。如血管抑素，可以直接抑制激活的内皮细胞的增殖和/或促进其凋亡[7]；干扰素α-2a可以阻断血管生成因子，降低肿瘤碱性成纤维生长因子信息核糖核酸和VEGF信息核糖核酸的表达，从而抑制血管的生成[8]。人参皂苷Rg3是从人参中分离提纯的四环三萜类人参二醇型皂苷单体，能抑制肿瘤细胞粘附和新生血管的形成[4]。
人乳腺癌可表达多种血管生长因子[9]。其中VEGF是一种广泛存在的内皮细胞特异性因子，抑制VEGF的活性或减少其受体KDR均能明显抑制实验性肿瘤的生长和转移的发生。敬静等[10]随访70例乳腺浸润性导管癌病例并对其病理切片进行检查，证实乳癌和癌旁组织VEGF表达显著高于良性病变，有血行转移或淋巴结转移者VEGF表达高于无转移者。本实验应用免疫组化方法发现Rg3组VEGF的蛋白表达明显低于对照组(P<0.05)，提示Rg3可能抑制肿瘤的新生血管形成。
肿瘤内MVD作为一种新的肿瘤生物学特性，它反映了肿瘤微血管形成的强度与肿瘤侵袭性的必然关系，可作为肿瘤转移的预测因子及判断预后的指标。Weider等[11]报道光镜200倍视野内MVD值>100的15例乳腺浸润导管癌全部发生转移；MVD值在34～100之间的转移率为30%～70%。MVD值<34的7例乳腺癌发生转移不足20%。本研究证明，应用Rg3治疗的裸鼠移植人乳癌的MVD值明显低于对照组(P<0.05)，提示Rg3亦可能有抗乳腺癌转移的能力。国内外学者对Rg3抗肿瘤作用的研究表明，Rg3降低肿瘤转移的机理可能与下列因素有关：（1）增加NO的产生，人参提取物能促进NO释放，而内源性NO可降低肿瘤转移能力[12]；（2）抑制肿瘤细胞粘附和新生血管的形成，Rg3可抑制B16-BL6细胞对基底膜的侵犯，从而降低肺转移的发生率，有效减少肿瘤血管的数量[13]；（3）抑制Ca2+内流[13]。

参考文献
1 赵扬冰.乳房保健与疾病防治.第1版.成都:四川科学技术出版社，2001；7，171
2 Folkman J.Clinical application of research on angiogenesis.New Engl J Med，   1995;333(26):1757
3 Thompson WD，William WL，Maragoudakis M，et al.The clinical manipulation of angiogenesis: pathology，side-effects，surprise and opportunities with novel human therapies.J Pathol，2000;190(3):330
4 高勇，王杰军，许青等.人参皂苷Rg3抑制肿瘤新生血管形成机制研究.第二军医大学学报，2001;22(1):40
5白绍槐，赵扬冰，张旋波等.人乳腺浸润性导管癌裸鼠移植模型的建立.华西医科大学学报，1999;30(2):220
6 Gasparini G， Harris A.Clinical importance of the determination of tumor angiogenesis in breast carcinoma; much more than a new prognostic tool. J Clin Oncol，1995;139(3):765
7 O’Reilly MS，Holmgren L，Shing Y，et al.Angiostatin:A novel angiogenesis inhibit or that mediates the suppression of metastasis by a Lewis lung carcinoma. Cell，1994;79(2):315
8 Slaton JW，Perotte P，Inoue K，et al. Interferon alpha mediated down regulation of angiogenesis related genes and therapy of bladder cancer are dependent on optimization of biological dose and schedule. Clin Cancer Res，1999;5(10):2726
9 Relf M，Lejeune S，Scott PA，et al.Expression of the angiogenic factors vascular endothelial cell growth factor，acidic and basic fibroblast growth factor， tumour growth b1，platlet-derived endothelial cell growth factor， placental growth factor and pleiotrophin in human primary breast cancer and its relation to angiogenesis.Cancer Res，1997;57(5):963
10敬静，李宏江，朱炜炜等.乳腺疾病中血管内皮生长因子表达及其意义.中国普外基础与临床杂志，2001;8(5):322
11 Weidner N. Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer. Am J Pathol，1995;147(1):9
12 Fan ZN，Isobe K，Kiuchi K，et al. Enhancement of nitric oxide production from activated macrophages by a purified form of ginsenoside(Rg1).Am J Chin Med，1995;23(3-4):279
13 Imamura F，Horai T，Mukai M，et al.Serum requirement for in vitro invasion by tumor cells. Jpn J Cancer Res，1991;82(5):493