导读：NaN3是一种特异性细胞色素C氧化酶抑制剂,NaN3纹状体内灌流可造成该脑区COX抑制，使线粒体功能障碍和细胞受损，进而导致纹状体细胞外液乙酞胆碱(ACh)水平下降。研究在此基础上，观察该模型动物脑细胞外液中与能量代谢有关的葡萄糖和乳酸水平的变化，为通过改善能量代谢保护脑组织的药物筛选提供可选用的研究方法，研究都可喜对脑能量代谢障碍大鼠纹状体细胞外液乙酞胆碱、葡萄搪和乳酸水平的影响。

NaN3是一种特异性细胞色素C氧化酶(cymchromeCoxidase，COX，也叫呼吸链复合体IV)抑制剂,NaN3纹状体内灌流可造成该脑区COX抑制，使线粒体功能障碍和细胞受损，进而导致纹状体细胞外液乙酞胆碱(ACh)水平下降。该急性模型可用于筛选防治老年退行性病变和其它脑细胞损伤所致智能减退的药物。本研究在此基础上，进一步观察该模型动物脑细胞外液中与能量代谢有关的葡萄糖(Glucose)和乳酸(lacticacid,LD)水平的变化，为通过改善能量代谢保护脑组织的药物筛选提供可选用的研究方法。

1材料与方法

1.1动物SD大鼠，体重170一180g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证编号SOXK(京)2002-0003

1.2试剂和药品氯化乙酞胆碱(acetylcholinechloride,ACh),氯化胆碱(cholinechloride,Ch)、甲基硫酸新斯的明(neostigminemethylsulfate)均购自Sigma公司。叠氮钠(sodiumazide,NaN3)是Merch公司产品。1%Kathon溶液由BAS公司提供。其余试剂均为分析纯。林格液(复方氯化钠注射液)为北京双鹤药业股份有限公司产品，批号:021018712。都可喜(duxil)为法国施雅药厂产品，批号:IG0838，上海福达制药有限公司分装。Gluco，试剂盒为北京中生生物工程高技术公司产品，LD测试盒为南京建成生物工程研究所产品。

1.3仪器脑内微透析系统包括CMA/12探针(透析膜长4mm)及探针套管,CMA/120清醒动物装置、CMA/102微量泵、CMA/110液体开关、CMA/170低温样品自动收集器及软件，为CMA公司产品。高效液相色谱(HPLC)系统包括CMA/260除气装置、PM-80泵、Rlieodyne7125进样阀、LC-4C电化学检M9器(ED),ACh分析柱(3Nm,100mmx4mm)及固定化酶反应器(immobilizedenzymereactor,IMER)、白金工作电极、Ag/AgCl参考电极和色谱工作站，为BAS和CMA公司产品。日本岛津的CL-720微流量分光光度计。手术使用设备:MF-5364立体定位仪、CMA/150动物温度控制器和MP-5360牙科钻，由CMA公司提供。

1.4方法大鼠随机分3组:对照组、模型组和都可喜组。每组6只大鼠。都可喜组以10mg·kg一’·d一‘连续灌胃14d，其余2组普通水灌胃14do2wk后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉(40mg·kg一’)，于纹状体内进行探针套管埋植术(定位坐标A;+0.2mm,L:+3mm,V:7.5mm)。术后24h插人探针进行透析。灌流速度为2闪·mimn-'，每30min收集1管。各组大鼠用林格液平衡120min后，对照组大鼠用新斯的明林格液(N-Ringer，含10p,mol"L-‘新斯的明的林格溶液)灌流510min;模型组和都可0组大鼠用N-Ringer灌流150min后，改用含NaN3,的N-Ringer液(NaN3,-N-Ringer，含30mmol"L-'NaN3，和10p,mol-L-’新斯的明的林格溶液)灌流120min，再恢复N-Ringer灌流240min,按照BAS公司提供的ACh/Ch试剂盒操作手册(MF-9053)，用HPLC-IMER-ED测定透析液中ACh含量"',CL-720微流量分光光度计分别测定透析液中Glucose和LD含量。所有探针在使用前作ACh回收率的测定。实验数据采用方差分析。

1.5色谱分析流动相:每升含85%磷酸3.4ml,1%Kathon5ml，用NaOH调pH至8.5。流速1.0ml，min一，。工作电压设为+500mV,滤波0.1Hz,增益0.2μA。标准曲线用。，125,0.25,0.5,1p.m·L一’的ACh标准液测定。

2结果

2.1都可喜对NaN3脑内灌流大鼠纹状体细胞外液ACh水平的影响见.rahto模型组大鼠在NaN3，处理前(。min)纹状体细胞外液ACh水平与对照组无差异(P均>0.05)oNaN3，处理期(90min)和停止NaN3,-N-Ringer灌流1h(180min),2h(240min),4h(360min)ACh水平均较对照组明显下降(P<0.05或0.01);都可喜组ACh水平在0,90,180和240min与模型组均无差异(P>0.05)，360min时明显高于模型组(P<0.05)。表明NaN3,脑内灌流可使大鼠纹状体细胞外液ACh水平下降，都可9有抑制NaN3脑内灌流所致的ACh水平下降的作用，其对正常大鼠ACh水平有升高作用。

2.2都可喜对NaN3，脑内灌流大鼠纹状体细胞外液Glucose水平的影响见Tab2。3组大鼠纹状体细胞外液的Glucose水平(未经探针回收率折算)在NaN3，处理前无差异(P>0.05);NaN3:处理期模型组和都可喜组均明显低于对照组水平(P<0.01或0.05)0停止NaN3,灌流1h和2h时模型组的水平仍低于对照组，而都可喜组则与对照组无差异(P>0.05)，在停灌2h时都可喜组Glucose水平明显高于模型组(P<0.05)。表明NaN3，脑内灌流可使大鼠纹状体细胞外液Glucose水平下降，都可喜有抑制NaN3,脑内灌流所致的Glucose水平下降的作用。

2.3都可喜对NaN3,脑内灌流大鼠纹状体细胞外液LD水平的影响见Tab3。在NaN3,处理前模型组与对照组、都可喜组纹状体细胞外液LD水平(未经探针回收率折算)无差异(P均>0.05);但都可喜组LD水平明显高于对照组(P<0.01)。在NaN3，处理期和停止处理1,2,4h，模型组和都可喜组的LD水平均明显高于对照组(P均<0.01)。表明NaN3,脑内灌流可使大鼠纹状体细胞外液LD水平升高，都可喜对NaN3脑内灌流所致的LD的升高无影响。其对正常大鼠LD水平有升高作用可能与其升高正常大鼠ACh水平有关。

2.4都可喜对NaN3脑内灌流大鼠纹状体细胞外液Glu/LD比值的影响见Tab4。在NaN3处理前模型组与正常组、都可喜组纹状体细胞外液Glucore/LD比值均无差异(P均>0.05).都可喜组明显低于对照组(P<0.05);在NaN3处理期和处理后1,2,4h，模型组和都可喜组的Glucose/LD比值均明显低于对照组(P均<0.01)。表明NaN3灌流可使大鼠纹状体细胞外液Glucose/LD比值降低，都可喜对NaN3脑内灌流所致的Glucose/LD比值无影响。

3讨论

先期的研究已表明NaN3,脑内灌流所致能量代谢障碍大鼠纹状体细胞外液ACh水平下降ulNaN3、是Cox的抑制剂,Cox活性下降可直接干扰线粒体呼吸链的电子传递，影响脑的能量代谢有报道脑缺血或脑损伤后能量代谢障碍，脑细胞外液Glue水平降低，LD水平则升高。脑组织的供能物质主要是Glucose,Glue代谢的异常是脑能量代谢异常的主要表现之一。脑的能量对维持细胞内外离子梯度、细胞膜完整性、神经元胞体和轴突之间的物质运输、细胞之间的信息传递、合成代谢、递质释放、摄取等至为重要。脑的生理功能对生物氧化供能具有很强的依赖性，脑能量代谢在保持脑生理功能中具有十分重要的意义;从神经化学、分子遗传学、细胞生物学、病理生理学等资料反映葡萄糖/能量代谢障碍在神经退行性疾病发生和发展中扮演着重要作用。

因此，Glue和乳酸(葡萄糖无氧酵解的产物，其堆积也反映了脑组织缺氧)成为研究脑能量代谢障碍和老年性痴呆的重要指标。ACh是胆碱能神经传导的内源性神经递质，脑内水平与学习记忆等脑高级功能正常密切相关，其代谢异常又与AD、帕金森病等神经退行性疾病的认知功能相关。通过测定脑内ACh的含量可以反映脑内胆碱能神经的功能，其含量水平的高低直接影响神经冲动的传递质量，对大脑的认知、记忆功能起着重要的作用。

本研究中不仅重复了NaN3所致的模型大鼠脑细胞外液ACh水平的下降，而且观察到细胞外液Glucose水平明显降低和乳酸的升高，以此充实、完善该模型;都可喜是增加脑供氧、改善细胞能量代谢的阳性药物，其对模型大鼠ACh水平的下降和Gluco，代谢有一定的改善作用，表明了该能量代谢障碍的模型可用于影响能量代谢的促智药物的筛选更有助于防治老年退行性疾病和脑保护作用的药物的研究。