1968年中国人民解放军第七军医大学本科毕业,1982北京医科大学研究生毕业。1984和1989年先后在澳大利亚新南威尔士州立大学圣.文森特医院和法国巴黎居里大学圣.安托万医学院客座研修。现任中华血液学会、中国实验血液学会常务委员,全军血液学专业委员会主任委员等。兼任《中华血液学杂志》、《解放军医学杂志》、《中国实验血液学杂志》、《临床血液学杂志》、等7本杂志的副主编或编委。在国内外权威性医学刊物上发表论文220余篇,主编医学专著4部。获国家级、全军及省级科学技术进步奖20余项。亨受政府特殊津贴。
异基因造血干细胞移植?HSCT?的目的是建立供者型的正常造血与免疫功能,以取代受者原有的异常的造血及免疫系统。其治疗恶性肿瘤的主要机制系利用正常供者的免疫系统识别和攻击突变的肿瘤细胞(移植物抗瘤效应,GVT)从而达到治愈目的。由于供受者间的免疫差异,即使HLA完全相合的移植,也难完全避免移植后的相互排斥,即发生移植物抗宿主病(GVHD)或移植排斥(HVG)。由此可见,成功的异基因造血干细胞移植的全过程,从供者干细胞的植入、充分发挥GVT效应、防治GVHD和HVG,到受者造血、免疫功能的重建、肿瘤的完全治愈并保持健康的生活质量,主要技术皆与免疫学密切相关。本文将就异基因造血干细胞移植免疫治疗方面的进展作简要介绍。
1.T细胞与移植
过去十年中,由于支持治疗,特别是先期的预防性抗感染治疗、生长因子的应用及外周血造血干细胞的采用已使HSCT的疗效取得突破性进展,移植相关并发症及病死率已大幅降低。防治GVHD的免疫抑制剂包括各类化疗药物、抗淋巴细胞球蛋白,抗TNF、CD52、CD25单抗等。尽管如此,GVHD仍是HSCT最棘手的并发症,激素是目前最有效的治疗药物。GVHD危及生命,但是采用各种免疫抑制防治的同时势必导致感染等各类严重的并发症及肿瘤的复发,因此目前的焦点问题是如何在防治GVHD的同时避免免疫抑制所造成的各种并发症。20多年前开始采用的去T细胞移植尽管使GVHD得到控制,但移植排斥、复发、因免疫重建延迟带来的严重感染等问题随之而来,更重要的是在HSCT治疗中最为关键的GVT效应大打折扣,去T细胞移植后的无病生存(DFS)与非去T细胞移植相比并无显著区别。临床资料表明,GVHD与GVT的关系错综复杂:GVHD的出现有助于降低肿瘤的复发率,但在无GVHD发生的情况下进行供者淋巴细胞输注(DLI)也可使白血病得到治愈,这一结果支持动物及体外实验中的发现,即GVHD和GVT效应两者的确是可分离的。目前的问题是:在临床移植中如何找到有效可行的办法,从而在防止GVHD的同时发现GVHD和其他免疫反应的区别,以保留GVT效应和机体针对感染的免疫应答。
随着对T细胞免疫反应和该过程中T细胞分化、成熟的深入了解,对异体移植物进行适当的处理、对其中不同的免疫反应细胞进行调控,已使加强GVT及抗感染效应、减轻或避免GVHD的发生成为可能。
1.1 通过选择性去T细胞分离GVHD和GVT效应
对异源反应性T细胞进行清除、转移或诱导无反应性,如CD40配体的抗体可阻断宿主抗原提呈细胞?APC?的第二信号,抗T细胞活化的抗体(CD69、CD25、Fas)通过中和免疫毒素或诱导凋亡而杀伤T细胞,免疫磁珠或流式分选转移已活化的T细胞等。新近采用的光动力学方法利用对光敏感的若丹明染料TH9042来清除T细胞,在可见光的作用下,药物发出放射活性从而选择性地杀伤活化的T细胞。
Michalex等的实验研究成功地找到了引起GVT效应和GVHD反应的T细胞确实来源不同的分子学证据,他们以病人的白血病或淋巴细胞刺激供者T细胞并通过TCR序列确认了白血病特异性克隆,GVT效应可被肿瘤特异性抗原(不引起GVHD)介导。因此选择性地去除非肿瘤细胞的抗原特异性T细胞,而不伤及肿瘤抗原特异性T细胞,便可达到分离GVHD和GVT的目的。在移植模型中,现已能成功地去除宿主抗原在体外激活的T细胞而并不损伤抗白血病效应。采用前述光动力方法,发现当带有染料的细胞被光照后,对宿主正常组织具有特异性的杀伤性T细胞显著减少,但肿瘤特异性T细胞及除此两者之外的第三类T细胞的大部分仍保留。选择性地去除T细胞或诱导T细胞无反应的临床试验已在开展,在半相合移植治疗儿童非肿瘤性疾病的临床研究中,以蓖麻毒素-A链免疫毒素选择性地去除CD25,初步的结果显示GVHD的发生率明显降低,并且虽然仅输入了小剂量的T细胞,免疫重建也明显优于非选择性去T细胞的移植。来自美国NIH的非清髓性HLA相合同胞移植研究,同样应用上述免疫毒素选择性去除1×108/kg的CD3+细胞,供者的反应细胞被置于宿主髓系细胞或B细胞的环境中,以使对系性限制性白血病或非白血病抗原发生反应的T细胞得以保留,结果显示供者细胞完全植入,GVHD减轻。
1.2 转移童贞(na?ve)T细胞
在小鼠试验中,童贞T细胞从未接触过抗原,表达CD62L,而接触过抗原的记忆或活化T细胞可能是CD62L+或CD62L-细胞。假设供者T细胞从未接触过宿主抗原,那么GVHD中被诱导的T细胞将是童贞T细胞,记忆/活化T细胞将不能诱导GVHD。混合淋巴细胞培养?MLR?显示异体细胞的增殖潜力在童贞细胞(CD62L+)群中更为突出,在移植模型中,分别将CD62L+和CD62L-输入体内?童贞T表型的细胞可引起GVHD?而记忆T细胞无此效应。
1.3 筛选Th2/Tc2细胞
目前已确认的功能性T细胞有:CD4+辅助性T细胞(Th1或Th2亚群)、CD8+杀伤性T细胞(Tc1或Tc2亚群)。Th1和Tc1分泌IL-2和IFN-γ,Th2和Tc2分泌IL-4、IL-5和IL-10。在动物实验中,供者Th2细胞不启动GVHD,但可介导GVT效应,且Tc2细胞发挥了强力的否决(Veto)效应而避免移植排斥?因此筛选Th2和Tc2细胞可促进植入,启动GVT效应而避免GVHD。上述动物实验的成功,促进了在非清髓性移植中输注Th2/Tc2细胞治疗血液系统恶性肿瘤的临床试验的开展。
1.4应用辅助性T细胞
辅助性T细胞为CD4、CD25阳性细胞,对诱导和维持自身耐受非常重要。动物实验中去除这种细胞会导致自身免疫或加剧GVHD;输注这类细胞,在自身免疫模型中可消除自身免疫,在移植模型中则可抑制GVHD。这一结果提示CD4+、CD25+辅助性T细胞具有强大的免疫调节作用,但同时动物实验中也显示去除这些细胞会促进肿瘤特异性免疫应答从而清除肿瘤,因此该类细胞的应用是否会消弱GVT尚需进一步的临床研究来证实。
2.NK细胞与移植
T细胞异基因免疫应答需要激活和扩增,NK细胞则通过与其他细胞间的相互作用产生一个阳性信号,而后通过释放穿孔素、颗粒酶直接杀伤靶细胞。研究发现T细胞是GVHD的主要效应细胞,而NK细胞则是GVT及HLA不相合移植成功植入的主要效应细胞。
2.1 NK细胞的活化与抑制
NK细胞表达CD25、CD16,不表达CD3,通过细胞毒性作用和分泌细胞因子如IFN-γ、TNF-α及GM-CSF等发挥效应。NK细胞对于移植的重要性源于其对MHC-I类抗原的识别。人类NK细胞至少表达四种活化型受体及两种抑制性受体。NK细胞对MHC-I类分子的特异性识别是通过含有免疫受体酪氨酸活化性基序(ITAM)的杀伤细胞免疫球蛋白超家族受体(KIR)和CD94家族的C型凝集素受体来实现。NKG2D是NK细胞活化型受体,可识别MHC-I类分子,其他活化型受体可识别一些尚未明确的配体。含有免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIM)的KIR和CD94家族的其他C型凝集素可抑制NK细胞的活化。编码活化及抑制型KIR的基因位于19号染色体,C型凝集素受体基因位于12号染色体。细胞表面受体介导活化和抑制信号的平衡从而调整NK细胞的功能,如图所示为NK细胞的活化与抑制模式?正常细胞表达的MHC-I类分子与NK细胞上的杀伤抑制型受体连接,活化信号被抑制使NK细胞不产生使靶细胞溶解的溶细胞活性。缺少MHC-I类分子表达的异常细胞,活化信号因不能被杀伤抑制性受体传递的抑制信号阻断,故被NK细胞溶解。
正常情况下,NK细胞表面的KIR识别靶细胞的MHC-I类分子配体,如HLA-C和HLA-Bw4等。由于NK细胞至少表达自身MHC-I类分子的一个抑制受体,KIR与自身细胞的MHC配体结合从而发出杀伤抑制信号,阻止NK细胞对正常组织的非特异性杀伤作用,从而对自身正常组织产生保护作用。当NK细胞不能识别自身MHC-I类分子时,杀伤的抑制信号不能传递,NK细胞即释放穿孔素/颗粒酶直接杀伤靶细胞,随即产生一系列临床免疫损伤。
2.2 NK细胞的异源反应活性
多数人表达较完全的KIR抑制性受体基因,可识别3组主要HLA-I类配体(第1组HLA-C,第2组HLA-C,HLA-Bw4)。对162例个体进行分析,97%的KIR表达KIR2DL基因,是第1组HLA-C抗原决定簇的受体;100%KIR表达KIR2DL2/3,为第2组HLA-C抗原决定簇的受体;94%表达KIR3DL1,是HLA-Bw4抗原决定簇的受体。KIR独特型不相合移植中,当异体靶细胞不表达I类等位基因时便不能阻断KIR,NK细胞即可发挥其溶细胞活性。
半相合移植中,由NK细胞介导的溶细胞活性由供者NK细胞的KIR独特型与受者HLA-I类分子的不相合所触发。这一作用目前被称为供者抗受者的NK细胞异源反应活性。在动物模型中,NK细胞强有力地攻击宿主的造血细胞,而对通常T细胞在GVHD中针对的靶组织则不具有杀伤作用。将人的异源反应活性NK细胞(KIR独特型不相合)输入已植入人AML细胞的NOD/SCID小鼠?在对照组,小鼠3周后死亡,而在治疗组,少量的人异源反应活性NK细胞即可清除白血病细胞,使小鼠得以存活。在子代F1 H2d/b小鼠(供鼠)与亲代H-2b小鼠(受鼠)的移植中,供者的NK细胞不表达H-2b特异性的Ly49C/I受体,而表达H-2d特异性的Ly49A/G2受体,因此供者NK细胞可杀灭宿主的靶细胞。研究还发现,即使输入大剂量的异源反应活性NK细胞给经过致死性放疗处理过的受者也并不导致GVHD。在非致死性放疗处理过的受者中,异源反应活性NK细胞可将骨髓和脾中的受者T细胞和中性粒细胞数降低至低于经致死性预处理的受者的水平。单独接受非致死性TBI(小于7Gy)预处理的小鼠对供者的骨髓移植物发生排斥,但同时接受异源反应活性NK细胞输注的小鼠,其体内则持续出现了供者型造血细胞。2×105个供者异源反应活性NK细胞即可导致受者体内出现供者型造血,而非异源反应活性NK细胞则不具备该效应。异源反应活性NK细胞甚至可以在非清髓性HSCT中发挥作用,经过非清髓性预处理的小鼠同时接受低剂量的异源反应活性NK细胞输注,可检测到大于80%的供者型嵌合;即使给予仅包括氟达拉宾的强度较低的预处理,也可达到30%以上的供者型嵌合。在移植后6周输入供者的异源反应活性NK细胞,可将混合型嵌合体转变为100%供者型嵌合。研究推测NK细胞使宿主免于GVHD损伤的保护机制在于异源反应活性NK细胞能攻击受者的APC细胞,而后者为启动GVHD所必需。
2.3 NK细胞在植入、GVHD及GVT中的作用(见图2)
综上所述,与T细胞的异源反应活性不同,NK细胞的异源反应活性因其下述特性非常适用于移植:①通过杀伤宿主的淋巴系造血细胞而促进植入。在HLA不相合移植中,供者NK细胞可产生移植物异源反应活性,从而通过识别和杀伤受者残留的淋巴系细胞有力地促进植入。②异源反应活性NK细胞可杀灭白血病细胞,从而发挥GVT效应。NK细胞遇到KIR独特型不相合的肿瘤细胞时,即表现出强大的细胞毒作用,这是HLA相合移植和自体移植不能比拟的。NK细胞不相合的优势已在AML患者半相合或无关供者去T移植后复发率显著降低中得到证实,但迄今为止?这一优势仅局限于髓性白血病和去T细胞移植。③ NK细胞强力攻击宿主的造血细胞,而对GVHD攻击的靶组织则不具有杀伤作用,因此并不诱导GVHD,进一步能通过杀伤宿主DC?树突状细胞?而抑制T细胞介导的GVHD。
2.4 异源反应性NK细胞在HSCT中的应用
实验证明,输入具异源反应活性的NK细胞与AML移植后复发率降低直接相关。体外研究显示,异源反应活性NK细胞具有显著的GVT效应,可100%杀灭白血病细胞,但只有少部分表达淋系标记的急性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞被溶解,这是迄今为止在原发肿瘤中对NK异源反应活性唯一不敏感的肿瘤细胞。
动物实验的成功已使一些研究小组选择性地开展NK细胞不相合的无关供者移植或半相合移植,并由此设想输注来自供受者之外的第三者的异源反应性NK细胞来增强GVT效应、防止GVHD。Ruggeri等在57例高危AML移植中输注异源反应活性NK细胞,结果白血病的复发率显著降低,同时也避免了GVHD。Velardi等对1993~2003年间的85例晚期AML(CR2≥80%)半相合移植进行了分析,结果显示输注供者不相合NK细胞促进了植入而未加剧GVHD,更有意义的是白血病的复发得到了有效控制。在无NK细胞异源反应活性的44例移植中(21例为CR,23例为复发病例),移植后的复发率为79%,无事件生存率(EFS)为7%;而在36例(23例为CR,13例为复发病例)输入NK异源反应活性细胞的移植中,移植后的复发率为17%,EFS为52%,由此得出结论,无NK细胞异源反应活性的供者是预测移植复发的独立因素。
KIR独特型可由PCR法确认,3%的人群不表达KIR2DLI,6%不表达KIR3DL1,KIR2DL2/3则100%表达,识别KIR基因型有助于最终确定具有异源反应活性NK细胞的供者。对此类供者的选择已由目前从父母兄弟姐妹的直系亲属范围扩展至姨表、叔表等亲系中。第1组、第2组HLA-C及HLA-Bw4抗原决定簇均表达者,找不到NK细胞不相合的供者,而仅有三者之一或三者之二表达者则有机会找到。