HCcAg-Fc融合基因修饰的树突状细胞功能研究
第四军医大学唐都医院(710038)
冯志华 李军 王全楚 周永兴
丙型肝炎病毒(HCV)感染是当前危害人数健康的重要传染病，至今尚无特异性的预防和治疗措施。树突状细胞(dendritic cell，DC)作为人体最强的抗原呈递细胞，可广泛用于肿瘤和感染性疾病的免疫治疗，其诱导的强烈的CTL反应在HCV基因治疗中具有很好的应用前景。本研究旨在构建出包含HCcAg-Fc融合基因的真核表达载体，转染经体外活化的DC，利用已建立表达HCV C抗原的靶细胞(P815-HCcAg)及HCV感染荷瘤鼠(Balb/c小鼠)模型，观察HCcAg-Fc融合基因疫苗修饰的DC所诱导的特异性CTL、抗体强度，以及对T细胞的增殖作用，探索HCcAg-Fc融合基因疫苗修饰的DC用于预防和治疗HCV感染的可能性和可行性。
材料与方法
一、质粒、细胞、动物及主要试剂
含人IgG1重链Fc段cDNA的pCMVsFc质粒由我科访美博士陈思毅(休斯顿Baylor大学医学院细胞和基因治疗中心副教授)惠赠。pcDNA 3HCcAg-Fc质粒的构建参见文献。pcDNA3和P815细胞株由本室保存。Balb/c小鼠：6～8周龄，雌性，购自第四军医大学动物中心。重组小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rmIL-4)以及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗小鼠DEC205(CD205)单克隆抗体均购自深圳晶美公司。自行配制含5ml/L牛血清蛋白(BSA)，200mg/L NaN3的磷酸盐缓冲液(PBS)。RPMI 1640完全培养液含1×105 U/L青霉素、1×105 U/L链霉素，100ml/L胎牛血清；新生牛血清购自华美公司；抗小鼠Fc单抗由我校免疫学教研室惠赠。Cyto Tox96非放射性细胞毒性试验(Non-Radioactive Cytotoxicity Assay)(乳酸脱氢酶法)试剂盒购自promega公司，抗HCV C单抗、FITC标记的羊抗鼠抗体以及FITC标记的抗鼠CD4单抗、PE标记的抗鼠CD8单抗均由本室保存。
二、小鼠骨髓DC的培养、分化及鉴定
Balb/c雌性小鼠10只，颈椎脱臼处死，无菌取双侧股骨和胫骨骨髓细胞，用Tris-NH4 C1缓冲液破坏红细胞，5min后加入PBS洗涤，以RPMI 1640重悬，37℃贴壁2h，RPMI1640洗去未黏附细胞，黏附细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基中进行培养，加入细胞因子rm GM-CSF，rmIL-4各1000U/ml，隔天筛选换液。于培养的第7日收集细胞，进行电镜观察，或用特异性免疫荧光单抗DEC205染色，在流式细胞仪上进行检测。
三、HCcAg-Fc基因疫苗转染DC
采用电穿孔法进行转染。将DC细胞重悬于800μl低压穿孔液中，取pcDNA3 HCcAg-Fc质粒和pcDNA3质粒各400μl，分别与等量细胞悬液混合后，移入两个穿孔杯中，通过低压电穿孔转染DC细胞。电穿孔仪为Bio-Rad GENEPULSER，设定电压为230V，电容为950μF。电穿后，将细胞转入6孔板培养(内置盖玻片)。24h后换液，48h后取出玻片，用15ml/L冷丙酮固定、免疫荧光法检测HCV C抗原的表达。
四、混合淋巴细胞反应(MLR)
取Balb/c小鼠脾脏铜网研磨，用Tris-NH4 C1缓冲液破坏红细胞，5min后加入PBS洗涤，以RPMI 1640重悬，37℃贴壁2h，收集上清未贴壁细胞，用含含20%小牛血清的RPMI 1640重悬。pcDNA3 HCcAg/Fc转染和pcDNA3转染的DC用PRMI 1640完全培养基悬液取DC和T细胞各0?1mL，加入96孔培养板混合培养，培养72h。加入四甲基偶氮唑盐(MTT)10μg，37℃继续孵育4h，弃去，每孔加入DMSO150μL，振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶免疫检测仪上测各孔A490值，计算刺激指数(SI)。SI＝实验孔A值/对照孔A值。
五、构建体外HCV感染细胞系及HCV感染动物模型
利用包含HCV C基因的真核表达载体转染小鼠肥大细胞瘤P815细胞(H-2d与试验小鼠Balb/c遗传背景相同)，经G418筛选，表达HCV C抗原者作为细胞模型；再将表达HCV C抗原的P815细胞皮下接种Balb/c小鼠，建立HCV感染皮下移植瘤。以此为HCV动物模型，观察不同基因疫苗修饰的DC治疗后肿瘤大小、成瘤时间和小鼠存活率的变化，并对组织切片进行HCV C抗原染色，比较不同基因疫苗修饰的DC诱导的CTL在体内对病毒的清除作用。
六、观察基因疫苗修饰DC诱导的特异性体液和细胞免疫反应
将融合基因修饰和非修饰的DC疫苗以5×105/100μl免疫接种Balb/c小鼠(两组各8只)后，在不同时间剪尾取血，1∶20稀释后酶联免疫吸附(ELISA)法检测免疫小鼠血清中HCV C抗体滴度(A490nm)；同时处死部分小鼠，常规取脾细胞作为效应细胞，利用电穿孔转染技术，将含HCV C片段的基因疫苗转染Balb/c小鼠肥大细胞瘤P815细胞，建立的HCV感染细胞系为靶细胞，进行体外杀伤实验，CTL活性测定用乳酸脱氢酶法，参照试剂盒说明书进行。设效/靶比分别为100∶1，50∶1，25∶1。靶细胞为2×105/ml，每个比例均设3个复孔。效应细胞和靶细胞作用4h，反应终止后，每孔取50μl上清液检测乳酸盐脱氢酶(LDH)的释放，以490nm波长测定A值，按说明书计算。计算方法：特异性释放＝〔(实验释放-效自发释放-靶自发释放)/(靶最大释放-靶自发释放)〕×100%。
七、观察DC疫苗对小鼠脾脏CD4+、CD8+细胞增殖作用
将制备好的DC疫苗免疫小鼠脾细胞加5ml红细胞裂解液(0?15mol/L NH4 C1，1mmol/L KHCO3，0?1mmol/L Na2 EDTA，pH7?2)，室温5min除去红细胞，流式细胞仪检测小鼠脾脏CD4+、CD8+细胞的变化，并以空载体转染组作为对照。
八、观察DC疫苗免疫后Th1/Th2细胞因子的变化
选取两种Th1/Th2代表性细胞因子IL-4，IFN-γ进行检测；DC疫苗免疫BALB/c小鼠后剪尾取血1∶100稀释，按试剂盒说明书步骤进行检测；绘制标准曲线求出各组细胞因子的值。
九、统计学处理
实验数据采用两样本t检验和单因素方差分析。
结果
一、小鼠骨髓DC的观察与鉴定
光镜下观察可见细胞形态不规则，有大量的突起，具典型的DC形态。在扫描电镜下观察培养7天的DC细胞，细胞表面具有大量的皱褶和不规则突起，采用FITC标记的CD205抗体进行直接免疫荧光染色，流式细胞仪测定分析显示，通过上述方法所采集到的细胞，其CD205阳性率约70%。
二、HCcAg-Fc融合基因电穿孔法转染DC前体细胞后DC的发育和HCcAg-Fc的表达
通过形态学观察和流式细胞仪分析，发现HCcAg-Fc基因电穿孔法转染的DC在培养12～14d后，发育为具有典型形态学及表型特征的DC细胞，HCcAg-Fc在电穿孔法转染细胞中的表达可达到50%。
三、混合淋巴细胞反应
混合淋巴细胞培养中，pcDNA3 HCcAg-Fc转染的DC在浓度为每孔1×104时，刺激指数比pcDNA3转染的DC高，提示HCcAg-Fc基因电穿孔法转染的DC具有更强的刺激T细胞增殖的能力，结果见表1。
四、HCcAg-Fc基因转染的DC免疫小鼠后诱导的特异性体液和细胞免疫反应
小鼠脾细胞的特异性CTL功能测定结果，融合基因转染组脾细胞的特异性CTL杀伤活性强于空质粒转染组合对照组(P＜0?05)，且杀伤活性与效应细胞数量成正比。
五、DC疫苗对小鼠脾脏CD4+、CD8+ T细胞增殖作用的观察
流式细胞仪检测结果显示：DC治疗组小鼠脾细胞CD4和CD8分别较对照组略有升高，且以CD8升高为主。
六、DC疫苗免疫后Th1/Th2细胞因子的变化
如表2所示，融合基因转染DC疫苗免疫后血中IFN-γ的升高幅度明显大于IL-4的变化(P＜0?05)，表现为Th1为主的T细胞亚群变化。
讨论
丙型病毒肝炎感染后易慢性化，多数发展为肝硬化甚至肝癌。因此，研究一种有效的抗HCV疫苗显得尤为重要。有效的抗原提呈应当能全面的诱导机体细胞和体液免疫反应，目前国内外免疫治疗和疫苗研制的主要目的就是增强抗原提呈，诱导全方位、强有力的CD8+ CTL、CD4+ Th 及B细胞应答，从而更有效地清除病原体及肿瘤细胞。DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，也是惟一能激活初始T细胞的抗原呈递细胞。因此，应用特异性DC进行抗肿瘤或抗病毒免疫实验的方法就应运而生；包括用抗原或多肽体外致敏DC后回输或免疫特定宿主，进行免疫治疗；将DC与肿瘤细胞融合成为新型带有DC功能及肿瘤特异性抗原的融合细胞瘤苗；以及利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染DC，使之在DC内持续表达相应特异性抗原等等，均诱导产生了特异性的免疫反应。但是，这些方法存在着DC激活时间短，治疗不彻底或病毒载体的安全性等问题。
近年来，以免疫球蛋白(主要是IgG1)Fc段为基础构建的新型免疫分子进展很快，有望用于新型免疫复合制剂的研制。IgG1的Fab与Fc是功能相对独立的片段，Fab中的可变区与抗原结合，而Fc段能与免疫效应细胞的Fcγ受体(FcγR)结合，发挥其调节免疫效应、细胞炎症效应、细胞毒性以及激活吞噬细胞的作用。DC本身表面带有FcγR，因此由FcγR介导的吞噬细胞内化的过程可加强免疫应答的抗原提呈。
本研究就是基于上述观点，提出了一种新型的抗原提呈策略，用构建的质粒转染DC，让DC自身产生抗原，继而诱导机体细胞和体液免疫反应。该策略的基本原理就是基因修饰DC后可分泌融合了IgG Fc段的HCV C抗原，然后这种抗原作为外源性抗原，经受体介导的内化途径呈递给MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子。这样，基因疫苗修饰的DC即可诱导出强有力的抗原特异性CD8+ CTL、CD4+ Th及B细胞免疫应答。
由于Balb/c小鼠(H-2d)DC表面的Fc Ⅰ型受体(Fcγ R I，即CD64)与人IgG1重链Fc段具有高亲和力，而HCV基因组内的核心区(C)是结构基因中最保守的区域，故在本实验中，将HCV C基因与IgG1 Fc基因融合，构建分泌融合蛋白的真核表达载体，转染体外活化的DC之后接种Balb/c小鼠，利用已建立的表达HCV C抗原的靶细胞(P815-HCV-C，H-2d)及荷瘤鼠(Balb/c小鼠)模型，观察该融合基因修饰的DC，在体内、体外诱导抗HCV特异性CTL、T细胞增殖及抗体应答的强度，以期为HCV防治提供新的思路和理论依据。
越来越式的证据表明，无论是疫苗还是基因治疗，只要能同时诱导CD8+、CD4+ 及B细胞免疫应答，那么也应该是阻止和控制慢性感染和疾病如HIV-1，肝炎病毒感染，结核杆菌感染和肿瘤等的最有效途径之一。该受体介导的抗原提呈策略，优点在于：①直接将基因疫苗转染经体外激活的DC，绕过功能低下DC对质粒DNA表达产物摄取不足的环节，使病毒抗原在DC内直接加工、提呈。②转染DC分泌的融合蛋白，一方面可通过Fc分子与DC表面Fcγ RI 结合，增强分泌抗原的内在化(通过受体介导的抗原内化较液相抗原的胞饮作用高1000倍)，同时对DC刺激增多增强，有利于功能低下DC活化，提高其抗原提呈功能。另一方面，分泌的融合蛋白可作为外源抗原，提呈给主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ，激活CD4+ Th，诱导特异性抗体产生；而活化的CD4+ Th据其分泌的Th1和Th2类细胞因子的不同，可调节免疫的平衡，增强细胞和(或)体液免疫应答的强度。③分泌的HCcAg本身就位于DC细胞内，这样就更能有效地被DC捕获，然后呈递给MHC I，增强CD8+ CTL、CD4+ Th细胞反应。④由于Fc分子能与多种免疫效应细胞和DC上的FcγR高亲和力结合，因此Fc和病毒抗原融合蛋白可以缩短病毒抗原在血液中的游离时间，减少蛋白酶对其的降解，显著提高其在体内的半衰期。
这种抗原提呈策略也适用于其他的细胞内抗原，适用于其他疫苗及免疫治疗的设计。该策略最大的优点就在于可以诱导针对特异性抗原产生的广泛的免疫反应。因此，我们可以预言，这种受体介导的抗原提呈在对肿瘤、感染甚至自身免疫疾病的治疗中将具有广泛的应用前景。值得一提的是，基因疫苗的安全性也受到广大研究者的关注，如引起免疫功能紊乱的可能性、外源基因随机整合的可能性以及抗DNA抗体产生的可能性等，尽管上述可能性微乎其微，但仍然限制了基因疫苗的临床应用。本文中的HCcAg/Fc融合基因转染的DC疫苗是否存在同样的问题尚需进一步研究。