原发性肝癌是亚、非洲最常见的恶性肿瘤之一，年平均发病约为30人。手术切除是重要的治疗手段，由于木后较高的复发率和大多数肝癌病人诊断时已不能手术，肝癌的预后差。肝癌对化疗不敏感，目前对肝癌转移复发有抑制作用的实验性干预药物难以上临床。肝癌转移是多步骤的过程，针对肝癌转移复发分子机理的生物治疗药物是干预的重要方向，肝癌是典型的多血管肿瘤，其复发与肿瘤血管形成有关，抗肿瘤血管形成治疗对肝癌转移复发的干预有特殊意义。寻找有效的抗肝癌转移复发的药物，对一些已在临床应用的药物探索其潜在的抗转移作用，筛选出具有实际应用价值者为临床直接应用，将极大地改善肝癌病人的预
后。并通过对其作用机理的研究推动肝癌复发机理的研究。
后。并通过对其作用机理的研究推动肝癌复发机理的研究。
第一部分：干预不同环节药物对肝癌转移复发和肿瘤生长作用的初步探索
一、标化实验动物模型（LCI-D20）
裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20是我所首次建立的原位移植人肝癌高转移模型，该瘤株在宿主体内展示100%的移植生长和转移，能在人体外模拟人肝癌转移的自然过程，是一株可供研究实验性干预人肝癌转移复发的理想模型。在此基础上，观察分别于原位移植LCI-D20肿瘤后不同时间根治性切除移植瘤后及未切肿瘤的荷瘤裸鼠的转移复发率和生存时间。结果发现：裸鼠种植LCI-D20肿瘤组织后第3周可出现肝内播散，肺转移率达70%，平均生存期45±天。于移植后7-14天切除肝移植瘤，术后处死时间延至5周，肿瘤转移复发率为100%，移植后11天切除肝移植瘤裸鼠平均生存期67±4天。从而确定本研究采用的动物模型一般分两组，
一组为接种后24小时即用药，观测药物对肝移植瘤生长的抑制，另一组为移植后7-14天切除肝移植瘤，24小时后给药，用药4-5周，观察其对转移复发的疗效。
裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20是我所首次建立的原位移植人肝癌高转移模型，该瘤株在宿主体内展示100%的移植生长和转移，能在人体外模拟人肝癌转移的自然过程，是一株可供研究实验性干预人肝癌转移复发的理想模型。在此基础上，观察分别于原位移植LCI-D20肿瘤后不同时间根治性切除移植瘤后及未切肿瘤的荷瘤裸鼠的转移复发率和生存时间。结果发现：裸鼠种植LCI-D20肿瘤组织后第3周可出现肝内播散，肺转移率达70%，平均生存期45±天。于移植后7-14天切除肝移植瘤，术后处死时间延至5周，肿瘤转移复发率为100%，移植后11天切除肝移植瘤裸鼠平均生存期67±4天。从而确定本研究采用的动物模型一般分两组，
一组为接种后24小时即用药，观测药物对肝移植瘤生长的抑制，另一组为移植后7-14天切除肝移植瘤，24小时后给药，用药4-5周，观察其对转移复发的疗效。
二、干预不同环节的药物对肝癌转移复发和肿瘤生长作用的初步探索
肝癌的转移与肿瘤及癌周组织表达雌雄激素受体有关，但临床肝癌的激素治疗效果不肯定。肝癌是典型的多血管肿瘤，肝癌组织中微血管密度与肝癌术后的转移复发有关。Droloxifene和2-羟基氟他胺分别阻断雌、雄激素受体与相应配体结合。维甲酸通过影响肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡而起抗肿瘤作用，也有抑制肿瘤血管形成的作用。α干扰素具有影响细胞增殖、分化、免疫功能的作用，也具有抗肿瘤血管形成的活性。本实验通过裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20进行体内抑制肿瘤转移复发及肿瘤生长实验，以探索有潜在阻断肝癌转移可能的已在临床应用的Droloxifene、2-羟基氟他胺(futamine)、全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)、以干扰素（interferon α，IFN-α-1b，商品名Sinogen)对肝癌转移复发和肿瘤生长的作用。发现Droloxifene，2-羟基氟他胺，ATRA对根治性切除术后肝癌的转移复发及肿瘤生长无抑制作用。在早期(7天)切除后大剂量IFN-α(3×107 U/kg/天)治疗组肝内复发率、肝内复发瘤大小、肝内播散灶、肺转移率、肺转移灶数目分别为 16.7%，3±mm3，0个，0%和0个；而对照组分别为100%，3224±1297mm3，4±1个，100%，及 6+2个。两者比较，差别有统计学意义(P＜0.01)。结果初步提示早期应用大剂量IFN-α对肝癌转移复发有抑制作用。
肝癌的转移与肿瘤及癌周组织表达雌雄激素受体有关，但临床肝癌的激素治疗效果不肯定。肝癌是典型的多血管肿瘤，肝癌组织中微血管密度与肝癌术后的转移复发有关。Droloxifene和2-羟基氟他胺分别阻断雌、雄激素受体与相应配体结合。维甲酸通过影响肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡而起抗肿瘤作用，也有抑制肿瘤血管形成的作用。α干扰素具有影响细胞增殖、分化、免疫功能的作用，也具有抗肿瘤血管形成的活性。本实验通过裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20进行体内抑制肿瘤转移复发及肿瘤生长实验，以探索有潜在阻断肝癌转移可能的已在临床应用的Droloxifene、2-羟基氟他胺(futamine)、全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)、以干扰素（interferon α，IFN-α-1b，商品名Sinogen)对肝癌转移复发和肿瘤生长的作用。发现Droloxifene，2-羟基氟他胺，ATRA对根治性切除术后肝癌的转移复发及肿瘤生长无抑制作用。在早期(7天)切除后大剂量IFN-α(3×107 U/kg/天)治疗组肝内复发率、肝内复发瘤大小、肝内播散灶、肺转移率、肺转移灶数目分别为 16.7%，3±mm3，0个，0%和0个；而对照组分别为100%，3224±1297mm3，4±1个，100%，及 6+2个。两者比较，差别有统计学意义(P＜0.01)。结果初步提示早期应用大剂量IFN-α对肝癌转移复发有抑制作用。
第二部分：IFN-α预防肝癌切除后转移复发和抑制肿瘤生长的作用
一、LCI-D20裸鼠体内应用IFN-α对肝癌转移复发和肿瘤生长的抑制
为探索IFN-α对肝癌生长、复发的作用及其剂量效应关系。采用不同剂量IFN-α通过棵鼠人肝癌转移模型LCI-D20进行体内实验。共种植105只。LCI-D20模型，其中64只裸鼠作为预防组于种植后第11天根治性切除移植瘤。于切除后第2天开始皮下注射不同剂量的IFN-α连续用药35天，于37天处死棵鼠，检测IFN-α对肝癌转移复发的预防作用。剩余的41只荷瘤裸鼠于种植后第2天开始给予不同剂量IFN-α治疗。治疗35天，于37天后每组剩余5只棵鼠继续治疗至死亡以观察IFN-α对生存期的影响，其余棵鼠处死，检测IFN-α对较大肿瘤负荷的治疗作用。结果裸鼠肝内移植括大小对照组为8475±2636mm3，IFN-α1.5×107 U/kg治疗组为769±287mm3，与对照组比较差别有统计学意义(P＜0.001)；3×107 U/kg IFN-α治疗组为13±9mm3 ，与对照组比较差别有统计学意义(p＜0.001)。裸鼠肺转移率对照组为100%(5/5)，IFN-α3×107 U/kg治疗组为0%，与对照组比较差别有统计学意义(p＜0.05)。IFN-α可延长荷瘤裸鼠生存时间。对照组平均生存期为45±4天，而IFN-α治疗1.5×107 U/kg剂量组和3×107 U/kg剂量组保鼠平均生再期分别为81±6天、105±24天，与对照组比较差别有统计学意义
(P<0.05）。IFN-α对根治性切除后肝癌转移复发有抑制作用。裸鼠肺转移率、肝内复发率、复发瘤大小对照组分别为100% 、100%、1786±538mm3。IFN-αl.5 × 107 U/kg治疗组分别为0、62.5%、11±4mm3，与对照组比较差别有统计学意义(P＜0.05)；IFN-α3×107 U/Kg治疗组0、12.5%、0.5mm3，与对照组比较差别有统计学意义(P＜0.001)。与对照组相比IFN-αl×l06 U/kg可明显抑制肝内复发瘤生长(1786±538mm3 v260±57mm3 ，P＜0.001）。按体表面积计算相当于人5.5MU，每周3次。为临床应用提供了参考。我们的结果显示长期大剂量应用IFN-α可以抑制肝癌术后转移复发和肿瘤生长，并呈剂量效应关系，为临床特别是肝癌术后方法复发的抑制提供了依据。
为探索IFN-α对肝癌生长、复发的作用及其剂量效应关系。采用不同剂量IFN-α通过棵鼠人肝癌转移模型LCI-D20进行体内实验。共种植105只。LCI-D20模型，其中64只裸鼠作为预防组于种植后第11天根治性切除移植瘤。于切除后第2天开始皮下注射不同剂量的IFN-α连续用药35天，于37天处死棵鼠，检测IFN-α对肝癌转移复发的预防作用。剩余的41只荷瘤裸鼠于种植后第2天开始给予不同剂量IFN-α治疗。治疗35天，于37天后每组剩余5只棵鼠继续治疗至死亡以观察IFN-α对生存期的影响，其余棵鼠处死，检测IFN-α对较大肿瘤负荷的治疗作用。结果裸鼠肝内移植括大小对照组为8475±2636mm3，IFN-α1.5×107 U/kg治疗组为769±287mm3，与对照组比较差别有统计学意义(P＜0.001)；3×107 U/kg IFN-α治疗组为13±9mm3 ，与对照组比较差别有统计学意义(p＜0.001)。裸鼠肺转移率对照组为100%(5/5)，IFN-α3×107 U/kg治疗组为0%，与对照组比较差别有统计学意义(p＜0.05)。IFN-α可延长荷瘤裸鼠生存时间。对照组平均生存期为45±4天，而IFN-α治疗1.5×107 U/kg剂量组和3×107 U/kg剂量组保鼠平均生再期分别为81±6天、105±24天，与对照组比较差别有统计学意义
(P<0.05）。IFN-α对根治性切除后肝癌转移复发有抑制作用。裸鼠肺转移率、肝内复发率、复发瘤大小对照组分别为100% 、100%、1786±538mm3。IFN-αl.5 × 107 U/kg治疗组分别为0、62.5%、11±4mm3，与对照组比较差别有统计学意义(P＜0.05)；IFN-α3×107 U/Kg治疗组0、12.5%、0.5mm3，与对照组比较差别有统计学意义(P＜0.001)。与对照组相比IFN-αl×l06 U/kg可明显抑制肝内复发瘤生长(1786±538mm3 v260±57mm3 ，P＜0.001）。按体表面积计算相当于人5.5MU，每周3次。为临床应用提供了参考。我们的结果显示长期大剂量应用IFN-α可以抑制肝癌术后转移复发和肿瘤生长，并呈剂量效应关系，为临床特别是肝癌术后方法复发的抑制提供了依据。
二、IFN-α对皮下移植肝癌生长的抑制
为了直接观察IFN-α对肿瘤生长的作用，我们将LCI-D20肿瘤组织植入棵鼠背部皮下。于移植后第2天开始皮下注射IFN-α(1.5×107 U/kg/天) ，连续用药35天，对照组皮下注射相同体积生理盐水，每5天观察肿瘤大小。对照红肿瘤在第35天肿瘤平均体积为6053mm3。应用l.5 × 107U/kg/天剂量的IFN-α对肿瘤生长有明显抑制，在第35天肿瘤平均体积为3308mm3 ，与对照组相比差别有统计学意义(p＜0.05）。
为了直接观察IFN-α对肿瘤生长的作用，我们将LCI-D20肿瘤组织植入棵鼠背部皮下。于移植后第2天开始皮下注射IFN-α(1.5×107 U/kg/天) ，连续用药35天，对照组皮下注射相同体积生理盐水，每5天观察肿瘤大小。对照红肿瘤在第35天肿瘤平均体积为6053mm3。应用l.5 × 107U/kg/天剂量的IFN-α对肿瘤生长有明显抑制，在第35天肿瘤平均体积为3308mm3 ，与对照组相比差别有统计学意义(p＜0.05）。
三、ATRA对IFN-α抑制肝癌转移复发和肿瘤生长的协同效应
本实验通过裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20进行体内实验，联用不同剂量IFN-α和ATRA并和单独应用IFN-α的疗效相比较，验证从RA对IFN－a是否有疗效的协同效应。结果显示在荷瘤裸鼠应用ATRA与不同剂量的IFN-α，治疗组裸鼠肿瘤大小分别为8097±2531mm3 、839±304mm3 和15±7mm3；肺转移率分别为80%、40%和0%。而单独应用上述剂量IFN-α肿瘤大小分别为7963±3214mm3、769±287mm3和13±9mm3；肺转移率分别为80%、40%和0%。结果与单独应用IFN-α比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。在根治性切除移植瘤的裸鼠应用ATRA与不同剂量的IFN-α治疗组裸鼠肝内复发瘤大小为1067±756、16±9和lmm3；肺转移率分别为90% 、0%和0%。单独应用上述剂量的IFN-α肝内复发瘤大小分别为1345±559 mm3、11±4mm3、lmm3；肺转移率为75%、0%和0%。二者比较差别无统计学意义(P＞0.05)。提示ATRA对IFN-α抑制肝癌转移复发和肿瘤生长无协同作用。
本实验通过裸鼠人肝癌转移模型LCI-D20进行体内实验，联用不同剂量IFN-α和ATRA并和单独应用IFN-α的疗效相比较，验证从RA对IFN－a是否有疗效的协同效应。结果显示在荷瘤裸鼠应用ATRA与不同剂量的IFN-α，治疗组裸鼠肿瘤大小分别为8097±2531mm3 、839±304mm3 和15±7mm3；肺转移率分别为80%、40%和0%。而单独应用上述剂量IFN-α肿瘤大小分别为7963±3214mm3、769±287mm3和13±9mm3；肺转移率分别为80%、40%和0%。结果与单独应用IFN-α比较，差别无统计学意义(P＞0.05)。在根治性切除移植瘤的裸鼠应用ATRA与不同剂量的IFN-α治疗组裸鼠肝内复发瘤大小为1067±756、16±9和lmm3；肺转移率分别为90% 、0%和0%。单独应用上述剂量的IFN-α肝内复发瘤大小分别为1345±559 mm3、11±4mm3、lmm3；肺转移率为75%、0%和0%。二者比较差别无统计学意义(P＞0.05)。提示ATRA对IFN-α抑制肝癌转移复发和肿瘤生长无协同作用。
四、体内外检测IFN-α抑制肝癌血管形成的作用
体外检测IFN-α对肝癌细胞株增殖的作用以及对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖和移动的影响。通过裸鼠角膜微囊移植模型检测IFN-α对裸鼠角膜形成新生血管的影响，以探讨IFN-α作用机理。结果表明IFN-α在浓度为1000U/ml对BEL-7402细胞增殖的抑制率＞5%，而其它肝癌细胞株包括MHCC97的增殖几乎不受IFN-α的影响。IFN-α可显著抑制HUVECs增殖，其ED50为50U/ml，并呈剂量效应关系。IFN-α浓度达100U/ml即显著抑制HUVECs的移动。通过肝癌裸鼠角膜微囊移植模型直观发现应用IFN-α使裸鼠角膜形成新生血管被明显抑制，在第ZI天，治疗组角膜新生血管积分为16±4，而对照组为27±6。
体外检测IFN-α对肝癌细胞株增殖的作用以及对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖和移动的影响。通过裸鼠角膜微囊移植模型检测IFN-α对裸鼠角膜形成新生血管的影响，以探讨IFN-α作用机理。结果表明IFN-α在浓度为1000U/ml对BEL-7402细胞增殖的抑制率＞5%，而其它肝癌细胞株包括MHCC97的增殖几乎不受IFN-α的影响。IFN-α可显著抑制HUVECs增殖，其ED50为50U/ml，并呈剂量效应关系。IFN-α浓度达100U/ml即显著抑制HUVECs的移动。通过肝癌裸鼠角膜微囊移植模型直观发现应用IFN-α使裸鼠角膜形成新生血管被明显抑制，在第ZI天，治疗组角膜新生血管积分为16±4，而对照组为27±6。
第三部分：IFN-α抑制肝癌血管形成的机理
一、IFN-α治疗后糠见血清血管内度生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)水平的变化
检测切除移植瘤后应用IFN-α（l.5×107 U/kg/天和3×107 U/kg/天）治疗裸鼠血清血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroflast growth factor，bFGF）水平，并与单纯切除移植瘤裸鼠及未切瘤的荷瘤棵鼠血清中VEGF和bFGF的水平比较。发现荷瘤者、单纯切瘤者、肿瘤切除后应用IFN-α1.5×107 U/kg/天和3×107 U/kg/天裸鼠血清VEGF含量分别为197.5±67.8pg/mL，265±154.7pg/mL，53.3±9.9pg/mL和65.2±17.9pg/mL。切除肿瘤后经IFN-α治疗者，其VEGF水平显著低于切除而未经治疗者，也低于未切除的对照组(P<0.05)。而IFN-α治疗对bFGF水平则无明显影响，治疗与非治疗者相仿。证实IFN-α可抑制肝癌细胞VEGF的产生。
检测切除移植瘤后应用IFN-α（l.5×107 U/kg/天和3×107 U/kg/天）治疗裸鼠血清血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroflast growth factor，bFGF）水平，并与单纯切除移植瘤裸鼠及未切瘤的荷瘤棵鼠血清中VEGF和bFGF的水平比较。发现荷瘤者、单纯切瘤者、肿瘤切除后应用IFN-α1.5×107 U/kg/天和3×107 U/kg/天裸鼠血清VEGF含量分别为197.5±67.8pg/mL，265±154.7pg/mL，53.3±9.9pg/mL和65.2±17.9pg/mL。切除肿瘤后经IFN-α治疗者，其VEGF水平显著低于切除而未经治疗者，也低于未切除的对照组(P<0.05)。而IFN-α治疗对bFGF水平则无明显影响，治疗与非治疗者相仿。证实IFN-α可抑制肝癌细胞VEGF的产生。
二、IFN-α对血管内度生长因子(VEGF)和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表达的影响
一氧化氮合酶活性的增高与VEGF及肿瘤血管形成关系密切，一氧化氮在VEGF诱导新生血管形成过程的每一步骤均起重要作用。应用RT-PCR方法分析根治性切除肝移植瘤后IFN-α治疗组（1.5×107 U/kg)和对照组复发瘤组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达水平结果显示，对照组肿瘤组织VEGF表达水平高于治疗组(P<0.05)。iNOSmRNA经PT-PCR扩增后，对照组肿瘤组织iNOSmRNA表达水平高于治疗组(P<0.05)。
一氧化氮合酶活性的增高与VEGF及肿瘤血管形成关系密切，一氧化氮在VEGF诱导新生血管形成过程的每一步骤均起重要作用。应用RT-PCR方法分析根治性切除肝移植瘤后IFN-α治疗组（1.5×107 U/kg)和对照组复发瘤组织血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表达水平结果显示，对照组肿瘤组织VEGF表达水平高于治疗组(P<0.05)。iNOSmRNA经PT-PCR扩增后，对照组肿瘤组织iNOSmRNA表达水平高于治疗组(P<0.05)。
三、IFN-α治疗后肝癌组织VEGF、iNOS表达及微血管密度(MVD)的变化
应用免疫组化方法分别检测到不同剂量IFN-α(1.5×107 U/kg/天，n＝9; 3 ×107 U/kg/天，n＝10连续35治疗及给予相同体积生理盐水的LCI－D20裸鼠肿瘤组织标本中iNOS和VEGF均为细胞浆着色，在19例治疗组肝癌组织中分别有36.8%（7/19）表达iNOS和VEGF；在13例对照组肝癌组织中分别有69.2% (9/13) 表达iNOS，76.9%(10/13) 表达VEGF，治疗前后VEGF表达差异有统计意义(P＜0.05）。1.5×107 U/kg/天、3×IO7U/kg/天治疗组肝癌组织肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）平均分别为66±5/每高倍视野，21±9/每高倍视野，而对照组肿瘤微血管密度平均为114±18/每高倍视野(P＜0.01）。结果提示IFN-α可以抑制VEGF的产生进而阻断肝癌血管形成。应用IFN-α可抑制VEGF及iNOS的核酸表达。初步表明IFN-α主要通过抑制VEGF、iNOS进而阻断肝癌形成新生血管。也提示VEGF及iNOS在促进肝癌的肿瘤血管形成中起一定的作用。
应用免疫组化方法分别检测到不同剂量IFN-α(1.5×107 U/kg/天，n＝9; 3 ×107 U/kg/天，n＝10连续35治疗及给予相同体积生理盐水的LCI－D20裸鼠肿瘤组织标本中iNOS和VEGF均为细胞浆着色，在19例治疗组肝癌组织中分别有36.8%（7/19）表达iNOS和VEGF；在13例对照组肝癌组织中分别有69.2% (9/13) 表达iNOS，76.9%(10/13) 表达VEGF，治疗前后VEGF表达差异有统计意义(P＜0.05）。1.5×107 U/kg/天、3×IO7U/kg/天治疗组肝癌组织肿瘤微血管密度（microvessel density，MVD）平均分别为66±5/每高倍视野，21±9/每高倍视野，而对照组肿瘤微血管密度平均为114±18/每高倍视野(P＜0.01）。结果提示IFN-α可以抑制VEGF的产生进而阻断肝癌血管形成。应用IFN-α可抑制VEGF及iNOS的核酸表达。初步表明IFN-α主要通过抑制VEGF、iNOS进而阻断肝癌形成新生血管。也提示VEGF及iNOS在促进肝癌的肿瘤血管形成中起一定的作用。
结论
1．本实验证实拮抗雌雄激素受体药物Droloxifene、2-羟基氟他胺以及分化诱导剂全反式维甲酸对肝癌肿瘤生长及根治性切除术后转移复发无抑制作用。
2．大剂量长疗程应用IFN-α治疗能够抑制肝癌的转移复发和肿瘤生长，其抑制术后复发的作用较抑制未经切除的移植瘤的作用更为明显。其效应是剂量依赖性。证实应用1×106 U/kg/天剂量IFN-α可显著抑制根治性术后肝内复发瘤的生长，相当于人5.5MU，每周3次。
3．IFN-α的作用机理为阻断肝癌的肿瘤血管形成。
4．IFN-α阻断肝癌肿瘤血管形成主要通过抑制VEGF而非bFGF的产生。一氧化氮在介导肝癌血管形成中与VEGF有协同作用。
1．本实验证实拮抗雌雄激素受体药物Droloxifene、2-羟基氟他胺以及分化诱导剂全反式维甲酸对肝癌肿瘤生长及根治性切除术后转移复发无抑制作用。
2．大剂量长疗程应用IFN-α治疗能够抑制肝癌的转移复发和肿瘤生长，其抑制术后复发的作用较抑制未经切除的移植瘤的作用更为明显。其效应是剂量依赖性。证实应用1×106 U/kg/天剂量IFN-α可显著抑制根治性术后肝内复发瘤的生长，相当于人5.5MU，每周3次。
3．IFN-α的作用机理为阻断肝癌的肿瘤血管形成。
4．IFN-α阻断肝癌肿瘤血管形成主要通过抑制VEGF而非bFGF的产生。一氧化氮在介导肝癌血管形成中与VEGF有协同作用。