赵霞 魏于全 彭芝兰 曹泽毅
【摘要】 目的 探讨豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)和γ-干扰素(γ-IFN )在卵巢癌及其他肿瘤治疗中的意义。方法 用PMA+γ-IFN处理的卵巢癌细胞及其他肿瘤细胞用流式细胞仪检测免疫球蛋白超家族糖蛋白的共刺激分子B7-1、主要组织相容抗原(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ)的表达情况。并采用51铬(51Cr) 4小时释放试验及［3H］胸腺嘧啶渗入法了解B7-1的表达对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性和对T淋巴细胞增殖的诱导情况。结果 预先用PMA处理，后用γ-IFN处理的肿瘤细胞，能诱导B7-1表达阳性的伯基特淋巴瘤细胞株或转染 B7-1基因的卵巢粘液性囊腺癌细胞的B7-1表达增强，能诱导无 B7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达的卵巢癌细胞株及其他肿瘤细胞株表达 B7-1及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，而单独用γ-IFN则不能诱导 B7-1表达。PMA和γ-IFN的这种协同效应能被蛋白激酶抑制剂1-( 5 -磺酰基)异喹啉-2 -甲基哌嗪盐酸盐(H7)阻断。被诱导表达的 B7-1能激活CTL的杀伤活性，并能增强T淋巴细胞的增殖能力。结论 γ-IFN诱导的B7-1的表达可能依赖于PMA预先激活蛋白激酶C。诱导B7-1等的表达对治疗肿瘤有一定的价值。
【关键词】 干扰素Ⅱ型 抗原，CD80 T淋巴细胞 淋巴细胞转化 十四酰佛波乙酯
Phorbol-12-myristate-13-acetate and Interferon-γ Synergistic Induction of B7-1 Expression in Ovary Carcinoma Cells and Immunological Value
ZHAO Xia, WEI Yuquan, PENG Zhilan, et al.
Department of Obstetrics and Gynecology, Second University Hospital, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To investigate the therapeutic potential of phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) and interferon-γ(IFN-γ) by induction of expression of adhesion molecule in mucious cystadenocarcinoma of ovary(MCAS) and other tumor cells. Methods Expression of costimulatory signals(B7-1), major histocompatibility complex(MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ) was analysed with flow cytometry. Cytotoxic T lymphocytes(CTL) killing activity and T cell proliferation induced with expression of B7-1 were evaluated by 4-h 51Cr release assay and standard3 HTdR incorporation and scintitation counting. Results Pretreatment with PMA and then treated with IFN-γ was able to enhance B7-1 expresssion on the tumor cell lines with the constitutive B7-1 expression or on B7-1-transfected tumor cells and to induce B7-1 expression on MCAS and some tumor cell lines without constitutive B7-1 expression. However, treament with IFN-γ alone failed to induce B7-1 expression on the tumor cell lines. The synergistic effect of PMA combined with IFN-γ in the induction of B7-1 expression can be anatagonised by H7 ［1-(5-isoquinolinesulfonyl)-2-methyl-Piperazine dihydrochloride］. In addition, treatment with PMA combined with IFN-γ simultaneously induced or enhanced the expression of MHC class Ⅰ/Ⅱ on these tumor cell lines. The tumor cells treated by PMA combined with IFN-γ were able to induce CTL killing activity and T cell proliferation, which is involved in the expression of B7-1. Conclusions The enhancement or induction of B7-1 expression by IFN-γ may be dependent on the prior activation of protein kinase by PMA and the induced B7-1 expression on tumor cells may have some therapeutic potential.
【Key words】 Interferon type Ⅱ Antigens, CD80 T-lymphocytes Lymphocyte transformationPhorbol myristale acetate
【Key words】 Interferon type Ⅱ Antigens, CD80 T-lymphocytes Lymphocyte transformationPhorbol myristale acetate
T淋巴细胞是人体抗肿瘤的主要免疫细胞，它的活化除需要组织相容抗原（MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ）递呈的特异性肿瘤抗原外，还需要共同刺激信号。免疫球蛋白超家族糖蛋白的共刺激分子B7-1在激活T淋巴细胞免疫过程中是传递关键性共同刺激信号的分子［1-4］。我们以前的研究也表明，转染 B7-1基因的肿瘤细胞能有效地激活 T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应［5］。
本研究观察了豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)和γ-干扰素(interferon-γ，γ-IFN)诱导B7-1和其他免疫分子在卵巢癌细胞及其他肿瘤细胞上的表达情况，探讨应用PMA和γ-IFN在肿瘤免疫效应中的意义。
本研究观察了豆蔻酰佛波醇乙酯（phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)和γ-干扰素(interferon-γ，γ-IFN)诱导B7-1和其他免疫分子在卵巢癌细胞及其他肿瘤细胞上的表达情况，探讨应用PMA和γ-IFN在肿瘤免疫效应中的意义。
材料和方法
一、材料
1.肿瘤细胞株：卵巢粘液性囊腺癌细胞株(MCAS)、伯基特淋巴瘤细胞株(Raji)、急性T淋巴细胞白血病细胞株( Molt-4)，由日本癌学会细胞库提供。卵巢浆液性囊腺癌细胞株（LM-1）、及转染B7-1基因的MCAS细胞株，由日本京都大学放射线生物研究中心建立。
2.其他试剂：γ-IFN购于美国Mallinckrodt公司，蛋白激酶 C (PKC)、PMA 和1-(5-磺酰基)-异喹啉-2-甲基-哌嗪盐酸盐( H7 )等购于美国Sigma公司。
1.肿瘤细胞株：卵巢粘液性囊腺癌细胞株(MCAS)、伯基特淋巴瘤细胞株(Raji)、急性T淋巴细胞白血病细胞株( Molt-4)，由日本癌学会细胞库提供。卵巢浆液性囊腺癌细胞株（LM-1）、及转染B7-1基因的MCAS细胞株，由日本京都大学放射线生物研究中心建立。
2.其他试剂：γ-IFN购于美国Mallinckrodt公司，蛋白激酶 C (PKC)、PMA 和1-(5-磺酰基)-异喹啉-2-甲基-哌嗪盐酸盐( H7 )等购于美国Sigma公司。
二、方法
1.T淋巴细胞的制备：取卵巢癌患者及健康人外周血，用肝素抗凝，集蔗糖梯度离心法分离，得到富含淋巴细胞的单个核细胞，经覆盖有血清的塑料平板吸附和尼龙网柱去除单核细胞和B淋巴细胞，得到的游离淋巴细胞，用 30%和 40%的硅化聚乙酰胺吡咯烷酮行非连续的梯度离心后，即得到静止T淋巴细胞。
2.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备：预先用PMA (50 nmol/L)处理24小时，再加入γ -IFN (100 U/ml)处理 24小时的卵巢癌细胞，或未经处理的卵巢癌细胞，经丝裂霉素（ 50μg/ml）处理1小时灭活。将1×105个灭活后的卵巢癌细胞与1×106个T淋巴细胞加在1 ml含有10% 小牛血清 (FCS)的RPMI-1640培养液中，接种于24孔平底组织培养板内。阻断实验用抗B7-1单抗 ( 5μg/ml)和对照抗体抗CD7单抗进行。培养6天之后，得到扩增的 CTL。
3.T淋巴细胞杀伤活性的计算方法：用标准4小时51铬(51Cr)释放试验分析，详见参考文献［6-7］。
4.T淋巴细胞增殖反应的检测方法：用［3H］胸腺嘧啶（3HTdR）渗入法测定，详见参考文献［6-7］。
5.流式细胞术：用美国Becton Dickinson公司生产的流式细胞仪检测B7-1、MHC-I、MHC-Ⅱ在肿瘤细胞上的表达。
1.T淋巴细胞的制备：取卵巢癌患者及健康人外周血，用肝素抗凝，集蔗糖梯度离心法分离，得到富含淋巴细胞的单个核细胞，经覆盖有血清的塑料平板吸附和尼龙网柱去除单核细胞和B淋巴细胞，得到的游离淋巴细胞，用 30%和 40%的硅化聚乙酰胺吡咯烷酮行非连续的梯度离心后，即得到静止T淋巴细胞。
2.细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的制备：预先用PMA (50 nmol/L)处理24小时，再加入γ -IFN (100 U/ml)处理 24小时的卵巢癌细胞，或未经处理的卵巢癌细胞，经丝裂霉素（ 50μg/ml）处理1小时灭活。将1×105个灭活后的卵巢癌细胞与1×106个T淋巴细胞加在1 ml含有10% 小牛血清 (FCS)的RPMI-1640培养液中，接种于24孔平底组织培养板内。阻断实验用抗B7-1单抗 ( 5μg/ml)和对照抗体抗CD7单抗进行。培养6天之后，得到扩增的 CTL。
3.T淋巴细胞杀伤活性的计算方法：用标准4小时51铬(51Cr)释放试验分析，详见参考文献［6-7］。
4.T淋巴细胞增殖反应的检测方法：用［3H］胸腺嘧啶（3HTdR）渗入法测定，详见参考文献［6-7］。
5.流式细胞术：用美国Becton Dickinson公司生产的流式细胞仪检测B7-1、MHC-I、MHC-Ⅱ在肿瘤细胞上的表达。
三、统计学方法
本研究资料的统计学分析采用t检验。
本研究资料的统计学分析采用t检验。
结果
一、PMA+γ-IFN对表达B7-1肿瘤细胞的作用
单独用PMA处理表达B7-1的Raji细胞24～48小时，能稍增强B7-1的表达，而单独用γ-IFN处理不能增强 B7-1在Raji细胞上的表达。但先用PMA (50 nmol/L)处理24小时，再加入γ-IFN(100U/ml)处理24小时，能明显增强 B7-1在Raji细胞上的表达，平均荧光强度可增至2倍。用PMA+γ-IFN处理Raji细胞与单用PMA或单用γ-IFN处理Raji细胞比较B7-1的荧光强度，差异均有极显著性（P<O.01）。这种效应与PMA的使用剂量相关。在诱导转染有 B7-1基因的MCAS细胞株B7-1的表达时，也可得到类似的结果。
单独用PMA处理表达B7-1的Raji细胞24～48小时，能稍增强B7-1的表达，而单独用γ-IFN处理不能增强 B7-1在Raji细胞上的表达。但先用PMA (50 nmol/L)处理24小时，再加入γ-IFN(100U/ml)处理24小时，能明显增强 B7-1在Raji细胞上的表达，平均荧光强度可增至2倍。用PMA+γ-IFN处理Raji细胞与单用PMA或单用γ-IFN处理Raji细胞比较B7-1的荧光强度，差异均有极显著性（P<O.01）。这种效应与PMA的使用剂量相关。在诱导转染有 B7-1基因的MCAS细胞株B7-1的表达时，也可得到类似的结果。
二、PMA+γ-IFN对未表达B7-1肿瘤细胞的作用
MCAS、LM-1和Molt-4细胞株经流式细胞仪检测未发现B7-1的表达。用PMA (1～200 nmol/L)单独处理这些细胞24～48小时，可不同程度诱导出B7-1的表达。而先用PMA (1～200 nmol/L)处理24小时，后用γ-IFN(100U/ml)处理24小时时，这些细胞表达B7-1的强度进一步增加。这种效应与PMA的使用剂量相关。用PMA+γ-IFN或单用PMA处理各组肿瘤细胞与未处理组比较B7-1的荧光强度，差异均有极显著性(P<0.01)。见图1。
MCAS、LM-1和Molt-4细胞株经流式细胞仪检测未发现B7-1的表达。用PMA (1～200 nmol/L)单独处理这些细胞24～48小时，可不同程度诱导出B7-1的表达。而先用PMA (1～200 nmol/L)处理24小时，后用γ-IFN(100U/ml)处理24小时时，这些细胞表达B7-1的强度进一步增加。这种效应与PMA的使用剂量相关。用PMA+γ-IFN或单用PMA处理各组肿瘤细胞与未处理组比较B7-1的荧光强度，差异均有极显著性(P<0.01)。见图1。
图1 PMA+γ-IFN诱导MCAS细胞B7-1的表达
三、H7对PMA+γ-IFN的作用
H7不影响固有的B7-1在Raji细胞和转染有B7-1的MCAS细胞上的表达，但抑制PMA +γ-IFN诱导的B7-1的表达。
H7不影响固有的B7-1在Raji细胞和转染有B7-1的MCAS细胞上的表达，但抑制PMA +γ-IFN诱导的B7-1的表达。
四、PMA+γ-IFN对MHC-I、MHC-Ⅱ的诱导作用
MCAS、转染B7-1的MCAS和LM-1不表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，Raji和Molt-4不同程度地表达MHC-Ⅰ，仅Raji细胞表达MHC-Ⅱ。PMA +γ-IFN能诱导上述几种表达MHC-Ⅰ的细胞MHC-Ⅰ表达增强，诱导不表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的细胞表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ。
MCAS、转染B7-1的MCAS和LM-1不表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，Raji和Molt-4不同程度地表达MHC-Ⅰ，仅Raji细胞表达MHC-Ⅱ。PMA +γ-IFN能诱导上述几种表达MHC-Ⅰ的细胞MHC-Ⅰ表达增强，诱导不表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的细胞表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ。
五、PMA+γ-IFN诱导B7-1表达的免疫效应
MCAS、LM-1等用PMA+γ-IFN处理后，能诱导异体CTL对其杀伤活性增强，而对未用PMA+γ-IFN处理的卵巢癌细胞的杀伤活性也增强，并刺激异体CTL的增殖。这些效应能被B7-1单克隆抗体抑制，表明诱导肿瘤细胞B7-1的表达能激发有效的T淋巴细胞介导的免疫反应。从新鲜卵巢癌组织分离的癌细胞经PMA+γ-IFN处理，同样能诱导 B7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达，能增强患者自身的CTL杀伤活性及细胞增殖。
MCAS、LM-1等用PMA+γ-IFN处理后，能诱导异体CTL对其杀伤活性增强，而对未用PMA+γ-IFN处理的卵巢癌细胞的杀伤活性也增强，并刺激异体CTL的增殖。这些效应能被B7-1单克隆抗体抑制，表明诱导肿瘤细胞B7-1的表达能激发有效的T淋巴细胞介导的免疫反应。从新鲜卵巢癌组织分离的癌细胞经PMA+γ-IFN处理，同样能诱导 B7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的表达，能增强患者自身的CTL杀伤活性及细胞增殖。
讨论
抗肿瘤免疫反应主要依赖于T淋巴细胞介导的细胞免疫，T淋巴细胞的激活依赖于MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ递呈的特异性肿瘤抗原刺激和B7-1等提供的共刺激信号。已有研究报道，无MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达的肿瘤细胞即使转染B7-1也不能诱导T淋巴细胞活化［8-9］。另一方面，如仅有肿瘤抗原刺激而无共刺激分子B7-1刺激时，T淋巴细胞不但不能被激活，反而使其丧失功能。表明在肿瘤细胞上的B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ共同表达才能有效地激活T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应。但MHC-Ⅰ在大多数肿瘤细胞常常是低表达，而MHC-Ⅱ几乎不表达，除了B细胞淋巴瘤外，绝大部分肿瘤细胞都没有B7-1的表达，因此，机体的抗肿瘤免疫力低下。
我们的研究发现，先用PMA处理MCAS等细胞，后用γ-IFN能诱导这些肿瘤细胞同时表达B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，这些有B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ同时表达的肿瘤细胞能激活外周血淋巴细胞，活化的CTL不仅对这些表达B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的肿瘤细胞杀伤活性增强，也对未用PMA+γ-IFN处理的肿瘤细胞的杀伤活性增强，同时增殖能力也成倍增加。
为了探讨PMA+γ-IFN诱导B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达增强的机制，我们发现用蛋白激酶抑制剂H7能阻断PMA的增强γ-IFN诱导B7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达的效应，提示γ-IFN的这种诱导B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达增强的效应，可能依赖于PMA预先激活PKC。
综上所述，本研究提示PMA与γ-IFN的合用可能对卵巢癌或其他恶性肿瘤有一定的治疗价值。
抗肿瘤免疫反应主要依赖于T淋巴细胞介导的细胞免疫，T淋巴细胞的激活依赖于MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ递呈的特异性肿瘤抗原刺激和B7-1等提供的共刺激信号。已有研究报道，无MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达的肿瘤细胞即使转染B7-1也不能诱导T淋巴细胞活化［8-9］。另一方面，如仅有肿瘤抗原刺激而无共刺激分子B7-1刺激时，T淋巴细胞不但不能被激活，反而使其丧失功能。表明在肿瘤细胞上的B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ共同表达才能有效地激活T淋巴细胞介导的抗肿瘤免疫反应。但MHC-Ⅰ在大多数肿瘤细胞常常是低表达，而MHC-Ⅱ几乎不表达，除了B细胞淋巴瘤外，绝大部分肿瘤细胞都没有B7-1的表达，因此，机体的抗肿瘤免疫力低下。
我们的研究发现，先用PMA处理MCAS等细胞，后用γ-IFN能诱导这些肿瘤细胞同时表达B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ，这些有B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ同时表达的肿瘤细胞能激活外周血淋巴细胞，活化的CTL不仅对这些表达B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ的肿瘤细胞杀伤活性增强，也对未用PMA+γ-IFN处理的肿瘤细胞的杀伤活性增强，同时增殖能力也成倍增加。
为了探讨PMA+γ-IFN诱导B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达增强的机制，我们发现用蛋白激酶抑制剂H7能阻断PMA的增强γ-IFN诱导B7-1、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达的效应，提示γ-IFN的这种诱导B7-1和MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表达增强的效应，可能依赖于PMA预先激活PKC。
综上所述，本研究提示PMA与γ-IFN的合用可能对卵巢癌或其他恶性肿瘤有一定的治疗价值。
本课题受国家自然科研基金资助(基金编号：39680030及39740006)及国家杰出青年科研基金部分资助(基金编号：39725031)
作者单位：赵霞 彭芝兰 曹泽毅 华西医科大学附属第二医院妇产科 成都 610041
魏于全 附属第一医院肿瘤生物治疗中心
魏于全 附属第一医院肿瘤生物治疗中心
参考文献
1 Linsley PS, Ledbetter JA. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annu Rev Immunol, 1993, 11:191-212.
2 Pulaski BA, Ostrand-Rosenberg S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class Ⅱ and B7-1 cell-based tumor vaccines. Cancer Research, 1998, 58:1486-1493.
3 Chen LP, McGowan P, Ashe S, et al. Tumor immunogenicity detemines the effect of B7 costimulation on T cell-mediated Tumor Immunity. J Exp Med, 1994, 179: 523-532.
4 Chen L, Linsley PS, Hellström KE. Costimulation of T cells for tumor immunity. Immunol Today, 1993, 14:482-486.
5 赵霞，魏于全.导入B7-1分子基因NK细胞敏感靶细胞诱导肿瘤免疫反应的研究. 中华医学遗传杂志，1998, 15:209-212.
6 Zhao X, Wei YQ, Kariya Y, et al. Accumulation of gamna/delta T cells in human dysgerminoma and seminoma: roles in autologous tumor killing and granuloma formation. Immunol Invest, 1995, 24:607-618.
7 Wei YQ, Zhao X, Kariya Y, et al. Induction of autologous tumor killing by heat treament of fresh human tumor cell: involvement of gamma/delta T cells and Heat Shock Protein 70. Cancer Research, 1996, 56:1104-1110.
8 Vandenberghe P, Delabie J, Boer Md, et al. In situ expression of B7/BB1 on antigen-presenting cells and activating B cells: an immunohistochemical study. Int Immunol, 1993, 5:317-321.
9 Becker JC, Brabletz T, Czerny C, et al. Tumor escape mechanisms from immunosurveillance: induction of unresponsiveness in a specific MHC-restricted CD4+ human T cell clone by the autologous MH class CII+ melanoma. Int Imunol, 1993, 5:1501-1508.
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