摘要
背景
肌萎缩侧索硬化是一种进行性运动神经元疾病，目前尚无恰当的治疗。有些研究提示兴奋性氨基酸神经递质谷氨酸可能参与发病机制。
方法
为评价抗谷氨酸药物利鲁唑的疗效和安全性，我们在155例肌萎缩侧索硬化门诊患者中开展了一项前瞻性、双盲安慰剂对照的试验。利鲁唑的剂量为每日100mg，按照起病部位（延髓或肢体）对患者进行随机化分层。主要终点为存活率和功能状态的变化速度。主要的次要终点为肌力的变化。在治疗12个月后和安慰剂对照期结束时分析进行（中位随访时间573天）。
结果
12个月后，安慰剂组78例患者中45例（58%）仍存活，而利鲁唑组77例中57例存活（74%）（p=0.014）。对于延髓起病的患者，1年存活率为：安慰剂组35%（6/17），利鲁唑组73%（11/15）（p=0.014）；而对于肢体起病的患者，1年存活率分别为64%和74%（p=0.17）。安慰剂对照期结束时，利鲁唑的优势较小（安慰剂为37%[29/78]，利鲁唑为49%[38/77]），但对于总的人群仍有显著性（p=0.046），对于延髓起病的患者也有显著性（18%[3/17] 53%[8/15]，p=0.013）。利鲁唑组肌力恶化显著慢于安慰剂组（p=0.028）。利鲁唑的不良反应包括虚弱、痉挛状态和转氨酶水平轻度升高。利鲁唑治疗组有27例患者退出研究，而安慰剂组为17例。
结论
抗谷氨酸药物利鲁唑似乎可以减慢肌萎缩侧索硬化的进展，有可能提高延髓起病患者的存活率。
肌萎缩侧索硬化是一种进行性和致死性神经变性性疾病[1]，存活期为几个月至几十年不等（中位数37-49个月）[2-5]。已知的预后因素包括起病时的年龄、起病部位、虚弱的持续时间和临床残疾的程度或呼吸功能[2-6]。这种疾病的病因不明，目前已知没有药物能影响其存活期。
本病的病因有许多假说[7]。一种假说认为谷氨酸（中枢神经系统中的主要兴奋性神经递质）在突触部位蓄积到毒性浓度，很可能通过钙依赖的机制导致神经元死亡。支持这一假说的依据包括：观察到谷氨酸代谢异常[8,9]，白细胞谷氨酸脱氢酶的变化[10]和脊髓与运动皮质的突触小体摄取高亲和力谷氨酸减少[11]。有人提出调节谷氨酸系统的药物有可能用于治疗肌萎缩侧索硬化[12,13]。
临床前研究发现，利鲁唑（2-氨基-6（三氟甲氧）苯并噻唑，RP54274）可调节谷氨酸能神经传递[14,15]。健康志愿者中进行的I期试验中，单剂利鲁唑200mg的耐受性好并且安全。
我们开展这项前瞻性、随机、双盲、安慰剂对照的分层研究，目的是为了明确利鲁唑是否对肌萎缩侧索硬化患者有益。主要终点为存活率和功能状态的变化速度。根据肌力、呼吸功能、患者对症状的主观评价、总的临床印象和患者对治疗的耐受性进行次要评价。
方法
试验按照欧洲药品临床研究质量管理规范指南[16]进行。
患者入选条件
20-75岁的门诊患者可以入选本研究。为确保诊断的准确性，入选时患者的临床状态必须符合很可能的或确诊的肌萎缩侧索硬化[17,18]。如果患者的肌电图上有运动神经、感觉神经传导阻滞或两者都有传导阻滞，免疫蛋白电泳有副蛋白血症，影像学（CT或磁共振成像）上有明显可以解释临床征象的病变，或有痴呆表现时，则予以排除。为提高结果的检出，如果患者自首发症状出现后病程已超过5年、患有其他致残性疾病或威胁生命的疾病、用力肺活量等于或低于预期值的60%、已经行气管切开、肝功能不全或肾功能不全、妊娠，则予以排除。
所有符合要求的患者签署知情同意书（必要时在配偶的帮助下）参加研究。入选工作于方案被Pitié-Salpétrière医院（巴黎）的伦理委员会正式批准后开始。
随机化和治疗
随机化按照患者治疗所在的中心（7个中心之一）和起病部位（肢体或延髓区域）分层。延髓起病的患者定义为在延髓区域有首发症状和体征，但他们在入选时临床上有确诊的肌萎缩侧索硬化或很可能有肌萎缩侧索硬化。肢体起病的患者有肢体的首发症状，即使入选时延髓受累。治疗分配在每个中心分别进行，并按照区组确定的随机编码进行。患者早晚餐前每日2次以50mg片剂服用利鲁唑100mg/日，或服用外观相同的安慰剂。利鲁唑片剂和安慰剂由RhônePoulenc Rorer（Antony, France）提供。
结果指标的测定和随访
入组研究之后，每名患者按计划每2个月检查一次。所有研究者在试验之前经过培训，以便提高评价功能状态和肌肉功能的可靠性。
主要疗效结果
主要疗效结果预先确定为治疗12个月后的存活率和功能状态的变化。测定存活率时包括的主要事件有死亡（各种原因）和气管切开，因为在疾病的终末期，呼吸衰竭可导致上述2个事件[4]。
以包含肢体功能、延髓功能、临床检验结果和患者症状得分的4分制评分来评价功能状态。这些量表的评定者间的可靠性在其他文献中已经得到证明[19]。肢体功能和延髓功能以改良的Norris量表（肢体功能的最高得分为63分；延髓功能最高得分为39分）进行评价[20]。于入选时及以后每2个月一次评价每个得分。
次要疗效结果
次要疗效结果包括肌力试验得分、呼吸功能测定、变化量表的临床总的印象得分以及患者对肌束震颤、痉挛、僵直和疲劳的主观评价，以4个100mm视觉模拟量表的表示。按照医学研究理事会的5级量表，评价患者坐位的22个肌肉功能（最高得分110分）[20]。以用力肺活量监测呼吸功能，并用预期值的百分比表示。于入选时及之后每6个月一次获得肌力、临床总的印象和视觉模拟量表的得分。
安全性、间发事件、停药和失访
每次访视时通过直接询问患者、临床和实验检查来发现有关药物不良反应和间发事件的信息。从研究入选至第7个月期间每2周一次，第8个月开始每2个月一次监测肝功能和肌酶。研究入选时及之后每2个月一次进行生化和血液学评价。在同一个实验室（CERBA，Saint Ouen l’Aumone, France）进行所有实验室检查的测定。
为测定研究药物的血浆浓度，从第1个月至第4个月每月一次，之后每2个月一次收集血标本（以含肝素的管子收集10ml）。标本于清晨给药之前采集，并送至中心实验室。1300×g离心10分钟后，分离出血浆并在约-18℃冷冻保存，直至研究结束时进行处理。停药的原因包括出现严重不良事件、丙氨酸转氨酶升高（达到正常值上限的3倍以上）以及患者撤回知情同意。停药不一定终止研究，在意向治疗分析中继续每2个月一次对患者进行随访。
如果出现失访，试验管理者尽可能从患者家人或家庭医生获取信息，并从患者出生地的政府索要死亡证明。
病例数和把握度
根据以往研究[2-5]和我们自己的数据[6,20]外推，提示延髓起病的患者12个月存活率为35%，肢体起病的患者存活率为65%，并且由于预期延髓起病与肢体起病的患者比例为1:2，得出安慰剂组估计的总存活率为55%。预先确定了最少病例数为110例，以便能以α水平为5%、β水平为90%和单侧检验，检测出1年的存活率由55%提高到85%[21]。
统计学分析
根据意向治疗进行统计学分析，把所有随机化的患者都包括在内。以包含分配的治疗、起病部位和这2个因素的交互作用的2因素方差分析比较入选时连续性的人口统计学数据和临床值。定性变量以Pearson卡方进行比较。各研究组的生存曲线以Mantel-Cox(时序检验)[22]统计量进行比较，并按照起病部位进行分层。
通过Cox比例-风险分析[23]以逐步的方法，并按起病部位分层，确定预后因素。还评价了治疗对存活率的影响，并控制选定的预后因素（通过Wald检验）。临床得分随时间变化的斜率以未加权的最小二乘方法进行估计[24]。模型中包含的因素为治疗（利鲁唑与安慰剂）、起病部位（延髓区与肢体）及这2个因素的交互作用。
虽然在设计分析时使用单侧假设，但与疗效相关的变量的统计学比较结果以双侧p值表示。
结果
人口统计学数据
从1990年6月至1990年11月，共入选155例患者（32例为延髓起病，123例为肢体起病）。数据截止的主要日期（1991年12月30日）设定为最后1例患者入选后12个月。这一日期之后，试验继续以双盲方式进行直至12个月疗效分析时（1992年3月），此时接受安慰剂的患者改为利鲁唑。
分析人口统计学数据、肢体和延髓功能得分以及肌力得分时，用的是治疗最初12个月的数据。分析存活率时，报告最初12个月期间及持续至安慰剂对照期结束（1992年3月12日）的数据。随机化至1992年3月12日的时间间隔为483至632天（中位数573天）。安全性分析时，结果是截止到至安慰剂对照期结束时。
77例患者被随机分配在利鲁唑组（62例为肢体起病，15例为延髓起病），78例患者分配在安慰剂组（61例为肢体起病，17例为延髓起病）。所有患者符合很可能的或确诊的肌萎缩侧索硬化的标准。24例患者不完全符合为防止入选疾病或特征可能干扰主要结果或安全性指标的患者而选定的标准。由于这些因素的选择是出于统计学把握度的考虑，并且由于这些患者都患有肌萎缩侧索硬化，因此决定在完全设盲的条件下将这些患者保留在试验中，并在不知结果的情况下将这些患者与意向治疗分析的其他患者合并。事后分析显示这些患者均匀地分布于各组：利鲁唑组11例，安慰剂组13例。按照危险因素进一步对这些患者进行分析显示，安慰剂组存活率阳性或阴性预测因素的极端值平衡（分别为7例和7例），而利鲁唑组这些值的分布不利（分别为3例和8例）。因此，在任何一组中危险因素的极端值无显著的不均衡。入选时2个研究组相似（不论是总体上还是按照起病部位分层）。延髓起病和肢体起病的患者之间的差异是预料之中的（表1）[4,6]。5例患者为本病的家族型（安慰剂组1例，利鲁唑组4例）。
存活率
存活率分析中，没有患者失访。2个研究组间，存活率的差异有统计学意义（图1）。12个月时，安慰剂组78例患者中45例（45%）仍存活，而利鲁唑组77例中57例（74%）存活（p=0.014）。排除了24例不符合各项入选标准的患者进行事后分析，发现对存活患者的百分比影响很小（12个月存活率，安慰剂组60%，利鲁唑组71%）。但由于排除了24例患者后统计学把握度显著降低，因此存活率差异不再有显著性（p=0.11）。
在总的人群中，安慰剂对照结束时，安慰剂组78例患者中29例（37%）仍存活，而利鲁唑组77例中38例存活（49%）（p=0.046）。安慰剂和利鲁唑组中位存活期分别为449天和532天。总体上，利鲁唑治疗使12个月时的病死率降低38.6%，21个月（安慰剂对照期结束）时降低19.4%，这一作用有临床上和统计学意义。
出乎预料的是，延髓起病的患者中治疗效果大于肢体起病的患者（图1）。在延髓起病的患者中，12个月时安慰剂组17例患者中6例（35%）仍存活，而利鲁唑组15例患者中11例（73%）仍存活（p=0.014）。安慰剂对照期结束时，组间仍有显著性差异：安慰剂组17例患者中3例（18%）仍存活，而利鲁唑组15例患者中8例（53%）存活（p=0.013）。安慰剂组中位存活期为239天，而利鲁唑组476天后未达到中位存活期。
表1：肌萎缩侧索硬化患者的基线特征，按治疗分配和起病部位分类*
*±
值为平均值±SD。统计学意义是以包含治疗组、起病部位、这2个因素相互作用的方差分析进行计算。治疗组见未观察到显著性差异，未发现治疗组与起病部位有相互作用。起病部位的比较在预期中。FVC指用力肺活量，CGI临床全面印象。
与接受任何治疗的延髓起病的患者相比p<0.05，双侧检验
图1. 用安慰剂或利鲁唑的肌萎缩侧索硬化患者的Kaplan-Meier生存率曲线。
图中下方显示的是每3个月阶段开始时每组中仍然处于危险中的病例数，以及死亡病例的累积数量。用Mantel时序检验对曲线进行比较。总体人群中（左图），12个月时两组的曲线有显著差异（p=0.014），21个月安慰剂对照阶段结束时两组的曲线也有显著差异（p=0.046）（中位随访时间573天）。延髓发病的患者中（中图），两组的曲线在12个月（p=0.014）和21个月（p=0.013）时有显著差异。肢体发病的患者中（右图），12个月和21个月时两组的曲线均无明显差异。
表2：研究期间死亡或气管切开的相对危险性，按治疗分配和入选时测定的预后变量分类*
*与存活率相关的变量有关的相对危险度和95%可信区间（CI）通过以起病部位分层的逐步Cox比例风险回归模型确定。对于每个变量，在校正其他显示的协变量之后计算相对危险度。p值通过Wald卡方检验获得，并提示变量对模型有显著性的贡献。相对危险度表示所考虑的期间内死亡或气管切开及变量按指定单位升高的危险性。
延髓功能的最高得分为39分，3分对应每个量表每项的正常功能。
疲劳和僵直的得分以视觉模拟量表测定，其值的范围为0-100mm。
在肢体的起病的患者中，利鲁唑组12个月内存活率有提高的趋势，62例患者中46例（74%）仍存活，而安慰剂组61例患者中39例（64%）仍存活。在这一亚组中，结果没有统计学意义（p=0.17）。安慰剂对照期结束时，安慰剂组61例患者中26例（43%）仍存活，而利鲁唑组62例患者中30例（48%）存活（p=0.355）。中位存活期没有显著的延长（安慰剂和利鲁唑组分别为523天与531天）。
危险因素的逐步分析（以Cox比例风险方法）选择出年龄、病程、用力肺活量、延髓功能得分、疲劳得分为入选时显著性的预后变量。校正这些变量后，治疗组间存活率的差异仅在12个月显著性（p=0.005）；在安慰剂对照期结束时接近达到显著性水平（p=0.058）（表2）。
图2. 用安慰剂或利鲁唑的肌萎缩侧索硬化患者中肢体功能和延髓功能得分以及肌力试验评分的每年恶化率，均数±SE。
每组研究的患者有75例，空白条图表示安慰剂组，斜线条图表示利鲁唑组，条图中的数字是每年的平均恶化率。斜率是用未加权的最小二乘方法估算出来的。肢体功能的组间差别为6.3±5.2，延髓功能的组间差别为2.5±3.0，肌力试验的组间差别为11.5±5.2。
功能评价
在12个月的随访期间，所有计划的访视中完成80%。5例患者仅有1次评价（安慰剂组3例，利鲁唑组2例），他们的数据不能用于功能得分的斜率估计，但这些患者的数据仍保留用于初始值的估计。对于每个功能得分，利鲁唑恶化的速度均比安慰剂组慢（图2）。但仅肌力试验得分的斜率有统计学意义（p=0.028），12个月时肌肉功能恶化的速度减缓33.4%。治疗分配、起病部位以及显示这2个因素相互作用的作用纳入在斜率分析中所用的模型中。仅治疗分配的作用有统计学意义，提示治疗作用相似，而不论起病部位如何。对于测定肢体和延髓功能的量表也如此。
药物不良反应和停止治疗
报告的有临床意义的药物不良反应包括虚弱加重、肌束震颤加重、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶或二者同时升高、血压轻度至中度升高（表3）。19例患者（安慰剂组6例，利鲁唑组13例）转氨酶水平升高。利鲁唑组的酶升高见于随机化后42-267天，安慰剂组的升高见于随机化后23-503天。利鲁唑组6例及安慰剂组3例患者中观察到丙氨酸转氨酶升高超过正常值上限的3倍。没有患者丙氨酸转氨酶的值超过正常值上限的5倍。利鲁唑组有丙氨酸转氨酶升高的患者中，5例停药，1例继续治疗。这名患者丙氨酸转氨酶的水平维持在正常值的2-4倍。利鲁唑组11例及安慰剂组3例患者天冬氨酸转氨酶升高。利鲁唑组1例患者中断治疗，后来又重新开始治疗，至研究结束时仍在研究中，其天冬氨酸转氨酶的值达到正常值的4倍，丙氨酸转氨酶的值持续低于正常值的2倍。利鲁唑5例患者同时有2种转氨酶升高，而安慰剂组无1例。利鲁唑组因转氨酶升高而停药的所有患者中，停药后2个月内酶水平恢复至基线值。研究期间总共44例患者停药（利鲁唑组27例，安慰剂组17例）。利鲁唑组27例患者中，19例因不良事件而停药，而安慰剂组15例停药的患者中9例是因不良事件。
表3：研究最初21个月内最常见的不良事件及不良反应所致的停药率
*有1例以上不良反应的患者仅计算1次
显示的值未包括呼吸系统症状后7天内死亡或气管切开的患者ALAT指丙氨酸转氨酶，ASAT天冬氨酸转氨酶。这些值升高超过正常值上限的3倍则认为是不良反应。
讨论
这项在155例肌萎缩侧索硬化患者中开展的随机、分层、双盲、安慰剂对照研究中，利鲁唑对存活率和肌肉恶化的速度有显著的效果。我们选择存活率作为主要终点，以便能区分药物可能的疗效与不减少运动神经元丧失的功能方面的对症治疗效果。利鲁唑对存活率的有益作用不能以其他混淆因素解释。当我们考虑以往报告的影响肌萎缩侧索硬化患者存活率的预测变量时[2-6]，我们未发现在入选时利鲁唑与安慰剂组之间有任何统计学意义的差异。当Cox比例-风险分析中控制其他危险因素时，治疗对12个月存活率的影响仍有显著性。
为研究代表性的肌萎缩侧索硬化患者，我们入选了病程范围较宽的患者。安慰剂组病死率在研究设计时估计的范围内，并与其他研究中报告的病死率[2-6,20]一致。我们的患者代表了肌萎缩侧索硬化的患者，大约包含了试验时法国这类患者总数中的5%。
利鲁唑对存活率有益的作用似乎取决于起病部位。延髓起病的肌萎缩侧索硬化患者中观察到较大的和显著性的效果，而在肢体起病的患者中，仅观察到阳性作用的趋势。很明显，利鲁唑在肢体起病的患者中的疗效较低，但就这一点来说，我们不能确切地说明因起病方式不同而使疗效出现差异的原因。但对亚组间这种显著差异进行解释时必须谨慎，Peto[26]
曾指出，这种作用可能是偶然产生的。不论起病部位如何，利鲁唑的治疗作用似乎与时间相关，在最初12个月内观察到很强的作用，而在12-21个月（安慰剂对照期结束时）作用明显降低。整个研究期间利鲁唑组停药的比例较高，可能导致低估了这种药物的实际受益，因为我们使用的是意向治疗分析。
虽然2个研究组中至少有1例不良反应的病例数相似，利鲁唑组药物相关的停药率显著较高。这些停药的原因包括虚弱、僵直、转氨酶水平升高。虽然利鲁唑组转氨酶升高较为常见，但尽管酶升高而继续用药的2名患者的耐受性依然很好。总体上，似乎报告的药物不良反应未超越其对存活率的治疗作用。药物不良反应可以使生活质量下降，但这一后果可能被药物对肌肉功能的作用所超越。
利鲁唑对肌肉功能的恶化速度有积极影响。这提示这种药物可能干扰疾病进程（即干扰运动神经元变性），尽管作用机制仍不明。利鲁唑在中枢神经系统突触前抑制谷氨酸释放[14,15]并在许多实验系统中突触后干扰兴奋性氨基酸的作用。但它似乎并不与任何已知的谷氨酸受体产生竞争性地相互作用，而是间接地拮抗这些神经递质的作用，可能是通过与电压依赖的钠通道[27]或G蛋白[28]发生相互作用。
不论其机制如何，利鲁唑可能会改变肌萎缩侧索硬化的病程。解密利鲁唑在肌萎缩侧索硬化中的生物学作用，可能会增加我们对疾病的发病机制的理解，并开启新的治疗途径。在利鲁唑可作为肌萎缩侧索硬化的治疗之前，还需要进一步的临床试验，例如对利鲁唑的剂量范围进行研究。