兰 林，王宇明
兰林，王宇明,中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所
摘要
迄今IFN-α仍是治疗乙型肝炎的主要抗病毒药物，但其总体疗效并不理想.究其原因，HBV基因组的多样性可能是重要原因之一.HBV种群具有高度的异质性，存在着多种不同的血清型、基因型及变异株，即使在单个感染个体内，也可能包含异质性的HBV病毒群体（准种）.研究发现不同的HBV株对IFN-α治疗的敏感性不同，个体内准种的异质性程度也对扰素治疗的应答性有影响.因此，正确深入地认知和分析HBV遗传异质性，对阐明影响IFN-α治疗的病毒学因素有着重要的意义.
兰林， 王宇明.乙型肝炎病毒遗传异质性对干扰素应答性的影响.世界华人消化杂志 2002;10(6):696-698
0 引言
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是目前威胁人类健康的最主要病原体之一. 他属于嗜肝DNA病毒科（hepadna viridae）家族. 其基因组由一个呈部分双链、松驰的环状DNA分子构成，DNA大约长3200（3182～3221）个碱基（bp）对. 其上有4个开放阅读框（open reading frame，ORF），转录至少4种mRNA，即3.5kb mRNA、 2.4kb mRNA、2.1kb mRNA和0.7kb mRNA，其中3.5kb mRNA又是病毒的前基因组RNA（pregenome RNA）. 翻译至少7种病毒蛋白质；S-ORF区的PreS1蛋白、PreS2蛋白和HBsAg，C-ORF区的HBeAg和HBcAg，P-ORF区的DNA聚合酶及X-ORF区的X蛋白. HBV基因组转录调控因子包括4种启动子（promoter）、2种增强子（enhancer）和多种其他cis活性因子区. 其中核心启动子又可再分为核心上游调节序列（core upstream regulatory sequences，CURS）和基本核心启动子（basic core promoter，BCP）2区. cis活性因子区有；位于S基因内的糖皮质应答元件（glucocorticoid responsive element，GRE），位于C基因上游的负性调节元件（negative regulatory element, NRE），肝细胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）结合位点，Sp1结合位点，位于C基因之中的转录终止信号（termination signal）以及最近在增强子I区域内新发现的干扰素（interferon，IFN）刺激调节成分（interferon-stimulated regulatory element，ISRE）样区域等. 病毒基因组存在着明显的基因重叠现象. HBV最大的特点是复制必需经过核糖核酸中间体（RNA intermediates ）逆转录（reverser transcription）过程. HBV种群的异质性很大，按血清学分类可分为adr 等9 种血清型，按基因型分类可分为A～G共7种基因型. 别外各型还存在着众多的变异株.
HBV感染可引起一系列的严重疾病，如暴发性肝炎、慢性活动性肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌. 全球超过3亿人口是慢性HBV携带者，在我国HBsAg阳性率达到总人口的10％. 目前使用的有效抗病毒药物主要有IFN-α和拉米夫定（lamivudine）. 拉米夫定是一种新使用的核苷类似物抗病毒药，其远期疗效尚需确认，初步结果提示他易诱导病毒变异株出现，从而产生耐药；同时，因不能清除cccDNA分子，易致停药后反跳；对HBeAg血清学转换效果不佳，且疗程偏长［1]. IFN-α属于IFN-α/β系统，具有抗病毒、抗增生、免疫调节作用及其他细胞效应. 在人体，IFN-α通过两条途径产生抗病毒作用；一是诱导感染细胞表达至少3种抗病毒蛋白；2""-5""寡聚腺苷酸合成酶、dsRNA-依赖的蛋白激酶和Mx蛋白，使细胞处于抗病毒状态. 二是调节机体免疫反应. 然而至今IFN-α抗HBV的确切机制并不完全清楚. 因为缺乏动物模型，有关IFN-α抗HBV的研究大部分是在体外进行的. 由于使用的肝癌细胞株不同，各研究者所得到的结果也不完全相同，不过大多数研究发现IFN-α能改变HBV多种蛋白质的合成?芄唤档筒《狙腔?蜃镽NA和病毒前基因组的稳定性. IFN-α的免疫调节作用是多方面的，主要表现在以下几个方面［2，8]： (1)增强MHC I型和II型抗原的表达和多种受体的表达，如；白介素-2受体（IL-2R）、肿瘤坏死因子-α受体（TNF-αR）、巨噬细胞膜上的Fc受体； (2)增强细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞和ADCC作用的活性； (3)直接作用于B细胞影响抗体的生成. 在IFN-α治疗的早期，病毒产物合成减少与其诱生的抗病毒蛋白有关，随后持续的疗效主要与其免疫调节作用有关［4]. 虽然IFN-α的抗病毒作用已经被普遍认可，但HBeAg 和HBV DNA的阴转率仅比对照组高20%， HBsAg 的阴转率仅比对照组高5～6％［5]. 影响IFN-α应答性的因素亦尚不清楚. 研究发现除宿主方面的因素外，在病毒方面，不同的病毒株对IFN-α有不同的敏感性，多种变异株显示对IFN-α有特别的抵抗力，HBV准种的复杂程度也对IFN-α的应答性有影响.现将有关研究综述如下；
1 HBV基因型对IFN-α应答性的影响
根据HBV基因组全序列的差异（>8％），或S基因序列的差异（>4.1%）［6]，HBV基因组可分为7个基因型（A～G）. 不同的基因型存在明显不同的地域分布和不同的致病能力. A型呈全球性流行，但主要分布在西北欧、北美和中非. B型主要发现在中国和东南亚. C型主要分布在中国和东亚. D型分布在地中海、中东和印度. E型分布在非洲. F型流行在美洲土著人和波利尼西亚群岛. G型是2000年新发现的基因型，首先发现在美国亚特兰大和法国里昂［7]. 在中国，一般认为主要的流行型是B型和C型，这与台湾地区的流行型相同［8]. 其中，南方以B型为主，北方以C型为主. C型常引起严重的肝脏损害，而B型感染病情较轻但容易引起肝硬化［9]. 除此之外，研究还发现不同的基因型对IFN-α的应答性也不相同. 台湾学者Kao et al［10］报道了58例B型和C型慢性感染患者IFN-α2b治疗的结果，B型和C型的应答率分别是41%和15％（P=0.045）. Sangfelt et al［11］用IFN-α治疗A～D四种基因型感染的儿童，其中获得良好应答的都是所谓非亚洲型的A和D型. Zhang et al［12］报道在A、D和E 3个HBV基因型中，A型对IFN-α的应答率最高为75％，而D和E型则匀为40％. Erhard et al［13］报道，A、B、C和D四个基因型对IFN-α的应答率分别是50%、4%、8%和38%. 另外还有报道，不同的基因型发生PreC区和BCP区突变的概率不同［14]，已有研究报道这些区域的突变对IFN-α的应答性有影响. 所感染HBV的基因型不同可能也是我国乙型肝炎容易慢性化和难以治疗的原因之一.
2 HBV变异对IFN-α应答性的影响
HBV虽然是DNA病毒，但因其复制过程的特殊性，HBV的自发突变率超过其他DNA病毒约4个数量级［15]. 在过去的10多年中，有关HBV变异临床意义的研究一直是热点之一. 有关病毒变异对IFN-α应答性影响的研究报道也很多. 由于HBcAg和HBeAg 在机体免疫应答中所起的特殊作用，因此研究主要集中在HBcAg和HBeAg的编码区和相应调节区的变异. 目前报道的位点主要有BCP、CURS、NRE、PreC区、C区突变和ISRE［16-18］.
BCP（1 742～1 849 nt）、CURS（1 643～1 742 nt）和 NRE（1 611～1 634 nt）均位于X基因区内. BCP 和CURS控制3.5kb mRNA转录，NRE的功能是拮抗BCP 和CURS的作用. 此区最常见的突变是A1762T和G 1764A. 突变的后果是HBeAg的合成量下降约70％，但HBcAg的合成和病毒前基因组的生成不受影响，病毒的复制能力增加［19］. Erhard et al［13］研究了这3个区域的突变对IFN-α应答性的影响后发现；CURS和NRE区域的突变与IFN-α的应答性无关. BCP区域的突变除A1762T和G 1764A外，重要的还有1753～1766nt区间的突变（在此区间聚集有HNF4、和Sp1等转录因子结合位点）. IFN-α的应答性与这些突变相关，但结果在HBeAg阳性和阴性患者之间截然相反，在HBeAg阳性的患者，IFN-α完全应答率与整个BCP区，特别是与1753～1766nt区域碱基突变数成正比（P<0.04，P<0.015）,亦与A1762T和G1764A突变呈显著相关（P<0.007）. 在HBeAg阴性的患者，IFN-α完全应答率与整个BCP区，特别是与1753～1766nt区域碱基突变数成反比（P<0.04，P<0.02）, 1762nt和1764nt为野生型者应答性高（P<0.003）.
PreC区和C区突变对IFN-α应答性的影响. Pre-C区突变的研究主要集中在G1896A nt终止突变［20]，C区突变的研究主要集中在CTL识别表位（HBcAg18～27aa）的变异上［21]. Zhang et al［22］报道35例成人患者在IFN-α治疗后发现；IFN-α的应答应性与治疗前HBV DNA水平和IFN-α的用量无关. 获得应答者 PreC区多为野生型，而非应答者嘤兄罩雇槐洌í玃<0.002）. Brunetto et al［23］报道了115例意大利患者的研究，结果与Zhang的报道相一致，另外还发现PreC区终止突变同时也影响HBV的自然清除，在有PreC区终止突变病毒感染的患者，自然清除率只有19％，而野生型则高达47%. 美国学者Naoumov et al［24］发现在IFN-α应答者中，PreC区和C区的错义突变明显少于非应答者（P<0.001）,并且发现在非应答者中全部存在HBcAg 18～27位氨基酸的替换. Fattovich et al［25］研究发现IFN-α非应答者在C区内B-细胞和T-细胞识别表位有更多的氨基酸替换. 提出可根据C区的变异预测患者对IFN-α的应答性. 但希腊学者Alexopoulou et al［26］和日本学者Shindo et al［27］的研究结果与上面的报道完全不同，他们的研究指出HBV PreC区和C区突变与患者对IFN-α的应答性无关.
ISRE通常存在于IFN-α诱导基因启动子中的一段序列（AGTTTCNNTTTCNC）. Nakao et al［28］首先在HBV增强子I内发现了一段相似序列（AGGCTTTCACTTTCTC），同时也在HBV和IFN-α处理过的细胞核提取物中发现；IFN刺激因子-3（interferon-stimulated gene factor 3 ，ISGF3）家族的ISGF3-γ（作者命名为p48）能与HBV增强子I内这段序列结合并且抑制了增强子I的活性，这段序列的突变和缺失都会减少IFN-α对HBV的抑制效果. 不过遗憾的是随后Rang et al［29］和其同事的跟踪研究并没有重复出相同的结果. 这片段序列的改变是否会影响对IFN-α的应答性尚需进一步研究.
3 HBV准种复杂性对IFN-α应答性的影响
病毒的准种（quasispecies）特性及其临床意义近来受到了越来越多的关注. 准种是复杂的、处于动态分布的彼此相关但又不完全相同复制子的集合（准种各成员之间，其差异程度一般不超过核苷酸总长度的2～5％）. 这是Eigen最早用于描述地球上早期生命形式的一个理论模型. 准种包括一个或几个主导序列（master sequence）和一个变异谱（mutant spectrum）. 主导序列是群体中的最适序列，他可与共有序列（consensus sequence）一致，亦可能不同. 复制的忠实性决定着突变谱的大小. 整个集合共同处于环境的选择压力之下维持着动态平恒. 准种理论与以前的群体生物学理论最大的区别是；不认为野生型是一个有明确核酸序列的单独的基因组，而是多种密切相关基因组构成的一个整体［30］. 在病毒学领域，目前准种的研究主要集中在RNA病毒，因为RNA病毒变异大，复制快，在很短的时间内感染个体中即可形成一个彼此密切相关的异质性病毒群体. 研究最多的是HCV和HIV. 病毒的准种特性实质上是其进化的一种生存优势，病毒最大限度地"制造"自己的大量变异序列，这些序列中可能包括了潜在有用的变异体，如对抗病毒制剂有抵抗能力、能逃避CTL攻击和诱导免疫耐受的突变体. 这样当环境改变后病毒可以快速的作出反应，从而保证其在宿主体内的生存. 最近的研究还发现病毒准种象人体免疫系统一样具有记忆能力［31]，当准种再次遇到经历过的环境作用时，保存在突变谱内的少量病毒株将迅速大量复制成为准种的主导序列.因此如果病毒准种的复杂性越大，治疗难度就可能越大. 在HCV的研究中已发现，病毒准种的异质性越大，对IFN-α的应答性就越差［32].有学者提出作为DNA病毒的HBV也存在准种特性. 已有少量的研究报道证实了这种假说［33]，有关HBV准种复杂性与IFN-α应答性之间相关性研究尚未见报道. 从我们最近的研究结果发现，HBV不仅存在准种特性，且在慢性乙型肝炎中准种的复杂性和异质性还很大. 同时也发现，在IFN-α应答的患者中，准种的复杂性明显小于非应答患者，这与在HCV的研究发现相一致.
总之，可见HBV的遗传异质性对IFN-α应答是有影响的. 然而，过去很多研究仅根据从患者血清中分离出的单个或少数几个病毒株或基因片段来判断某一变异株对IFN-α治疗的影响，这是不准确的，因为他们仅仅窥视了病毒准种的少数成分，慢性乙型肝炎患者血中HBV DNA拷贝数常在百万至十亿之间，随机抽取单个或少数几个克隆株不可能代表其准种组成，所以难免得到一些彼此矛盾的研究结果. 分析HBV对IFN-α应答性的影响，必须注意到病毒的准种特性. 在我国大多数的HBV感染者是通过母婴垂直传播感染的，大多经过了一个很长的感染期，部分患者还可能已经接受过多种/多次的抗病毒治疗. 在其体内早已形成了一个复杂的异质性的病毒群体，因此对HBV准种特性的研究显得尤其重要. 准种理论与既往群体生物学理论的最大差别是；不再把野生型看成一个有确定核酸序列的单个基因组，而看成一群密切相关基因组构成的一个整体. 准种理论最大的特点是；从患者体内整个病毒群体水平上去认识病毒的生物学特性及临床意义，不再注重某种单个的野生型或变异株的作用. 准种理论指导我们从一个全新的方式去认识HBV的生物学特性及临床意义. 通过对HBV准种生物学特性以及HBV准种的形成与急性HBV感染的慢性化、慢性HBV感染的临床转归之间的相互关系的深入研究，可能为探索抗HBV感染的治疗方法提供重要线索.
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