·靶向治疗的背景情况
　　·表皮生长因子受体
　　·HER1/EGFR作为肿瘤治疗靶点的机理
　　·特罗凯^®的靶向作用机制

靶向治疗的背景情况

　　细胞毒性药物的概述

　　二十世纪中后期开发了许多新的治疗非小细胞肺癌的细胞毒性药物。有效药物能直接损伤DNA或者在细胞分裂之前干扰DNA复制或染色体分离。例如铂类化合物与DNA发生交联，引起DNA损伤并阻止其复制。抗代谢药吉西他滨和5-FU都是DNA碱基化学类似物。因此，这些化合物干扰DNA的合成而阻断细胞周期的S期（即DNA复制）。喜树碱干扰DNA复制的解链酶，也阻止细胞周期的S期。紫杉类阻止纺锤体的形成，导致在细胞分裂之前染色体不能分离。

　　所有这些药物的作用集中于细胞分裂的关键环节，它们有效地阻止了快速增殖的恶性肿瘤细胞。因此，这类药物对正常组织中增殖迅速的细胞也有毒性，例如胃肠道、骨髓、头发毛囊、男性生殖器官等。这些药物对快速增殖的细胞的无选择性及其细胞毒性，因而限制了它们的临床应用。

　　因此，临床上需要开发新的对肿瘤细胞特异性更高的靶向性抗癌药物，并减少对正常组织的毒副反应。通过对肿瘤细胞生物学的深入理解，有关这方面的研究已经取得了一定进展。

　　肿瘤细胞生物学的研究进展

　　背景

　　细胞增殖对维持正常健康组织是必不可少的，但是这个过程必须接受严格调控。已知有3种主要控制细胞增殖的方式，因为有多种因子可能介导不止一个过程，所以这种分类也不是十分精确的：

　　·远距离来源信号（例如激素和生长因子）。
　　·来自周围环境信号（例如由临近细胞产生的生长因子，这种生长因子与细胞外基质发挥作用）。
　　·临近细胞的生理性影响（例如接触抑制）。

　　肿瘤的发生、增殖和进展（肿瘤发生）是对细胞生长失去正常控制导致的多步骤过程。单个肿瘤的生长是单个细胞克隆性增殖形成的。由正常细胞转化成肿瘤细胞，在（基因组成的）细胞的遗传学上需要3～6个关键的独立变化步骤。

　　癌基因

　　癌基因（指能使正常细胞转化为肿瘤细胞的基因）最初在RNA包涵病毒中发现。通过这种病毒感染分离细胞，能使细胞发生不可控制的增殖并使细胞失去分化能力。这种细胞的行为特征是恶性肿瘤的典型表现。

　　不久以后，研究发现每个癌基因在非肿瘤细胞的DNA中都有一种对应的原癌基因。原癌基因对于每种正常细胞的生理功能都是必不可少的。随着原癌基因转变为癌基因，正常细胞也转化为肿瘤细胞。常与以下几种机制有关：

　　·基因重排——同源染色体中原癌基因的重新排列导致基因表达失调。
　　·缺失或点突变——改变了功能蛋白的DNA编码序列。
　　·基因扩增——产生大量原癌基因。
　　·抑癌基因的缺失导致原癌基因无限制的表达。

　　大多数原癌基因（和癌基因）编码的蛋白参与调节正常细胞周期。原癌基因编码的蛋白质包括：

　　·生长因子
　　·生长因子受体
　　·酪氨酸激酶（细胞质中与膜有关的）
　　·三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白
　　·丝/苏氨酸特异性蛋白激酶
　　·基因调节蛋白

　　生长因子

　　许多癌基因编码生长因子，表1概括生长因子及其功能。在细胞周围环境中存在大量的生长因子，和它们的受体特异性地相互作用调节着细胞的生长和分化。生长因子的失调是肿瘤组织生长失控的一个基本特征。而且，转化细胞能过度分泌生长因子，形成正反馈环（自分泌刺激），从而加速肿瘤的生长和进展。

　　生长因子受体

　　其它的癌基因产物包括生长因子受体。其中的一些蛋白质嵌在细胞膜上，并和生长因子有很高的亲和力。生长因子受体结构非常复杂，分为几个大家族，通常在不同的细胞和不同分化组织中有不同的形式和表达。总的来说，细胞表面肽生长因子受体结构区包括细胞外配体结合区、跨膜区和胞浆区。

　　细胞内信号传导

　　生长因子与生长因子受体结合，通过下游一系列的信号传导，改变了细胞的功能。其中关键的一步是通过自身磷酸化激活酪氨酸激酶（位于该受体的胞浆区）的活性。胞内蛋白能够结合激活的酪氨酸激酶，导致结合信号蛋白的磷酸化。细胞内有大量的信号传导蛋白，其中多数是作为癌基因的产物被发现的。例如结合激活酪氨酸激酶区细胞内蛋白包括磷脂酶3激酶（PI3K），三磷酸鸟苷酶激活蛋白（GAPs），磷脂酶C（PLC）家族成员等。这些分子快速刺激细胞内信号传导通路或激活其它的效应分子（例如与DNA有关的蛋白质和酶类）。

　　这些通路的激活最终导致基因表达的改变，引起包括细胞增殖、分化、运动等变化在内的多种细胞应答。

　　概述：肿瘤细胞生物学的研究进展

　　·细胞增殖对维持正常的健康组织是必不可少的。
　　·肿瘤组织生长、发育和进展是由于细胞生长失去正常调控而引起的多步骤过程。
　　·最初在RNA包涵病毒中发现了癌基因。感染的细胞出现不可控制的细胞增殖和分化能力的丧失。
　　·原癌基因在正常细胞中表达，对维持正常细胞的功能十分必要。
　　·原癌基因的遗传学突变导致正常细胞转化为肿瘤细胞。
　　·原癌基因和癌基因编码的蛋白质参与正常细胞周期的调节。
　　·许多癌基因编码的生长因子调节细胞生长和分裂。
　　·生长因子的失调是细胞生长失控的一种机制，也是肿瘤的一个基本特征。
　　·癌基因同样也编码生长因子受体。
　　·生长因子与其受体结合导致下游信号传导的级联反应，引起基因表达的改变，从而引发一系列的细胞应答（例如增殖、分化等）。

      表皮生长因子受体

　　细胞周围环境和肿瘤中的生长因子

　　所有组织中的细胞分泌可溶型的生长因子到周围环境中。这些因子直接调节同一组织中（通过自分泌或旁分泌）或者不同组织中（通过内分泌）的细胞的功能。然而，一些生长因子最初是以一种没有活性的前体形式表达的。这些前体可能是细胞表面或细胞外基质中的结构分子。有活性的生长因子通过蛋白激酶激活或与细胞外基质成分特异地作用后释放。生长因子和细胞受体相互作用发生一系列应答。细胞对周围环境中的细胞因子的应答依赖于受体的数量及其表达的种类。众所周知，生长因子在肿瘤的生长和生存中起着重要作用。

　　人表皮受体（HER）

　　表皮生长因子是发现的第一个生长因子。它促有丝分裂的作用是由HER1/EGFR的结合介导的。该受体是现在称为HERs受体家族成员之一。HER家族由四个成员组成，它们有一定的共同蛋白序列和同源结构（图1）：

　　·HER1（EGFR，erbB1）
　　·HER2（erbB2，neu）
　　·HER3（erbB3）
　　·HER4（erbB4）

　　每个受体都是跨膜蛋白，它们由三个不同的结构区组成，包括细胞外区，跨膜部和细胞内区。细胞外区参与配体和受体的特异性结合，而HER2并没有天然的配体。疏水的跨膜部与细胞内和细胞外区相连，并在细胞膜上锚定受体。细胞内通常具有酪氨酸激酶活性（特别是HER3）。细胞内位点的磷酸化通过酪氨酸激酶激活下游信号传导。

　　HER配体

　　这个配体超家族包含很多蛋白质（分泌型的与膜结合型的），它们有着广泛的功能。这些蛋白包括：蛋白激酶、凝固因子、粘附分子、细胞外基质蛋白和肽生长因子等。其中肽生长因子见表2。肽生长因子和EGF有50个氨基酸的“EGF-同源区”，这些同源区是结合和激活EGF的先决条件。EGFR的配体中量最多的是EGF和TGF-α。

　　HER1/EGFR的激活

　　在非激活状态下，HER受体以单一蛋白单体形式表达于细胞膜上。配体与受体的细胞外区结合后通过诱导两个邻近受体形成二聚体而激活受体。HER1/EGFR可形成同型二聚体（即两个HER1/EGFR受体）或异型二聚体（即与HER2、HER3或HER4结合－图2）。二聚体的形成可以导致受体构象的改变，这种构象的改变通过至多五个不同位点的酪氨酸残基自身磷酸化而激活酪氨酸激酶区。除了与配体结合以外，HER1/EGFR的所有功能，都依赖于酪氨酸激酶区的激活。

　　HER二聚体的细胞内区的磷酸化位点是下游信号传导蛋白的特异性结合位点。这些蛋白也通过磷酸化而引起构象改变从而被激活。

　　HER1/EGFR信号传导

　　多样性

　　通过激活的配体和形成同型或异型二聚体类型的不同，HER1/EGFR的激活能在细胞内产生一系列作用。这些二聚体中，HER1/EGFR与HER2形成的二聚体最常见，但也能够和HER3或HER4形成异型二聚体。HER1/EGFR与HER2形成的异型二聚体相对地非常稳定，因而导致下游信号传导延长和细胞应答增强。

　　次级信号传导的多样性，是由于细胞内区域的多肽序列和4种HER受体中自身磷酸化的酪氨酸残基的不同引起的。然而，与HER受体及激活的信号传导通路结合的下游信号传导蛋白有高度重叠。

　　下游信号传导

　　激活的HER1/EGFR同型或异型二聚体结合于很多不同的细胞内分子，从而触发下游信号传导通路（图3）。多种信号传导通路都相互联系，而且十分复杂。特异性信号传导通路的激活决定于配体和二聚体的类型。

　　HER1/EGFR诱导的两种主要的信号传导通路是丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路和P13-Akt通路。MAPK通路对于调节细胞增殖非常重要。P13-Akt通路主要参与细胞死亡和生存的调节。研究证实，刺激这两个信号传导通路可能导致化疗耐药。

　　激活的HER1/EGFR的其它下游作用：

　　·游走－组织内细胞的生理移动。
　　·粘附－细胞和细胞外基质的相互作用。
　　·侵袭－通过组织屏障的能力，如血管壁等。
　　·血管生成－刺激新生血管生长。

　　总之，HER1/EGFR的所有这些下游信号传导通路，有助于肿瘤细胞的转化、生存和生长。

　　信号终止

　　一旦达到一定的刺激水平后，许多受体-信号传导系统都有一些关闭受体激活的方法。EGF或TGF-α与HER1/EGFR结合，诱导二聚化的受体聚集在细胞表面。这些二聚体被细胞膜融合形成的泡囊胞吞到胞质中去（胞吞作用），胞浆酶能降解受体和配体，因此能使配体－受体复合物失活。这个过程依赖于酪氨酸激酶的激活，突变的受体缺乏酪氨酸激酶活性，不能在胞质中降解，并再循环到细胞表面。胞吞、降解（或再循环）的速度取决于二聚体的组成。例如，HER1/EGFR同型二聚体快速内陷胞吞和降解导致下游信号传导显著下降。然而，HER1/EGFR和HER2形成的异型二聚体降低了胞吞率，因而延长了活性。

　　概述：人表皮受体（HER）

　　· HER家族由4个密切相关的跨膜受体组成，是HER1/EGFR、HER2、HER3、HER4。
　　·每个受体有3个不同的结构区：细胞外配体结合区，锚定跨膜区和具有TK活性的细胞内区（HER3缺乏激活内源性TK）。
　　·HER1/EGFR和HER2参与正常细胞的生长分化。
　　·许多配体可与HER家族结合（HER2除外，因它没有已知的天然配体）。
　　·正如所有的HER家族成员一样，HER1/EGFR在无活性时是以单体形式存在的。
　　·配体结合引起同型二聚体化（相同受体的单体之间）和异型二聚体化（不同单体之间，如HER1/EGFR-HER2）。
　　·HER2是最常见的异型二聚体化的配偶体，这可能与它没有天然的配体有关。
　　·由于HER3没有内在酪氨酸激酶活性，所以它必需形成异型二聚体才能激发信号传导。
　　·在配体结合、二聚体化和酪氨酸激酶磷酸化以后，一个复杂的细胞内信号传导级联放大途径就被激活了。
　　·这些级联通路对细胞的影响包括：
　　－促进细胞增殖
　　－侵袭
　　－转移
　　－血管生成
　　－抑制凋亡

     HER1/EGFR作为肿瘤治疗靶点的机理

　　正常组织中的分布和功能

　　HER1/EGFR在中胚层细胞器官（例如骨骼、肌肉、心脏、血管等，但不包括血细胞）和外胚层器官（例如皮肤、神经系统、感觉器官等）中表达。在胚胎生长发育过程中，经HER1/EGFR的信号传导对表皮的发育、增殖和器官形成等非常重要。在成熟组织中，HER1/EGFR的表达受到严密的控制，它的激活能刺激细胞增殖取代损伤或坏死的细胞（图4），并能通过抑制程序性细胞死亡或凋亡来维持细胞数量（图5）。HER1/EGFR也刺激细胞分泌其它生长因子，例如血管内皮生长因子VEGF，在组织重建过程中，用以促进新生血管的生长 。

　　HER1/EGFR在肿瘤中的表达

　　HER1/EGFR最初作为正常哺乳动物结构活性突变的病毒癌基因（V-erbB）的原癌基因，能在鸟类中引起红细胞增多症。大量的研究表明：HER1/EGFR和（或）其一级配体中的任一个（例如TGF-α）的过度表达或失调是人类许多实体肿瘤（包括肺癌、结直肠癌、卵巢癌、脑、头颈部肿瘤）的一个分子学特征（表3）。在人类肿瘤中也观察到HER2过表达现象，这是个非常重要的发现。尽管HER2没有天然的配体，HER2同HER1/EGFR的异型二聚化能减少胞吞和降解率，促进其再循环到细胞表面。所以，HER2的过度表达提高了配体激活的HER1/EGFR-依赖性MAPK的活性，并增加了肿瘤转化与生长的潜能。

　　众所周知，HER1/EGFR在人的肿瘤中表达，更深入的研究表明：它的表达随着疾病的进展而提高，并在肿瘤转移和化疗开始耐药期间表达得更为显著。例如，与非转移性结肠癌标本相比，转移性结肠癌活检标本的HER1/EGFR mRNA表达提高了5倍。假设细胞功能由HER1/EGFR信号传导产生（图4、5），很清楚HER1/EGFR功能失调使肿瘤细胞提高了对化疗的耐受程度和转移的潜能，因此晚期肿瘤中，具有影响细胞功能的遗传学异常细胞占绝对多数。然而，尽管很多的研究表明在HER1/EGFR失调和临床预后差（包括缓解率低、总体生存时间短）之间有一定的相关性，但重复性差，有些研究者发现，HER1/EGFR的状态和预后之间没有联系。

　　Nicholson等人的综述认为HER1/EGFR的检测方法在不同研究间存在着差异，而且检测蛋白表达本身可能不是HER1/EGFR功能失调充分的标志物。尽管如此，因为HER1/EGFR的表达在不同肿瘤类型中对预后的判断价值不同，作者仍建议据此将实体肿瘤分为三类（强、中、弱）。

　　总之，HER1/EGFR失调可能是几个潜在的遗传学改变之一，这些遗传学改变能导致肿瘤的转化和进展，HER1/EGFR的重要性在不同的肿瘤中可能不同。

　　HER1/EGFR的信号失调

　　因为HER1/EGFR信号传导途径很复杂，所以有多种机制能引起HER1/EGFR功能失调（图6）。

　　提高受体表达

　　如上所述，在许多不同的实体肿瘤中均报道有HER1/EGFR的过度表达。正常细胞表面表达2×104~2×105个HER1/EGFR受体，而在乳腺癌细胞中其表达能增加10倍。基因的扩增或突变促进HER1/EGFR的转录、mRNA的翻译，或提高这些受体蛋白的稳定性，从而导致HER1/EGFR的过度表达。在非小细胞肺癌中，HER1/EGFR表达的密度与抗细胞凋亡的下游信号传导有关。

　　增加配体的表达（自分泌）

　　配体水平的提高将促进受体的信号传导， HER1/EGFR的刺激性过表达导致HER1/EGFR的自分泌刺激，并引起不可控制的生长。一项有关EGFR阳性肺腺癌患者的研究发现，与没有EGF或TGF-α表达的患者相比，有EGF或TGF-α共同表达的患者生存期更短，也说明了这一点。

　　HER2和其它受体的相互作用

　　如前所述，HER1/EGFR同型二聚体很快被胞吞和降解，因而在和配体结合后的应答中的信号传导很弱。HER2在人许多肿瘤中高表达（表3），通过增加EGF结合亲和性、提高异型二聚体的稳定性和再循环率、提供更多的细胞内可结合到激活的受体复合物底物的变异性，来增强HER1/EGFR的信号传导。HER1/EGFR与HER2的共同表达能促进异型二聚体的形成，与更强的有丝分裂信号和更高的转化潜能有关。HER2能削弱特异性HER1/EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的作用、HER1/EGFR-TKI能阻断HER2的转激活，提示这两种受体之间存在协同现象。

　　综上所述，HER2的高表达能通过HER1/EGFR促进信号传导，提高肿瘤转化的潜能并促进肿瘤的生长。

　　其它受体介导的通路也能调节或激活HER1/EGFR信号通路，如由神经递质、淋巴因子、应激诱导因子等刺激的信号传导通路。激活的G蛋白能激活Src，Src能磷酸化HER1/EGFR，同样某些类固醇激素能通过G蛋白的激活而刺激EGF的分泌或激活EGFR。图7示其它受体信号传导通路对HER1/EGFR的激活。

　　EGFR突变

　　有多种突变能导致HER1/EGFR失调。其中最有特征性的就是EGFR vIII，在外功能区缺少270个氨基酸（外显子2~7缺失），而导致受体的细胞外结构区被删节。EGFRvIII缺少配体时可结构性激活，并不被胞吞作用下调。该突变常与HER1/EGFR的基因扩增相关。在高分化的神经胶质瘤中EGFRvIII的表达约占40%，低于非小细胞肺癌、乳腺癌和卵巢癌。其在肿瘤中的表达与临床预后差相关，可能是因为EGFRvIII与HER1/EGFR一样，参与诱导调控细胞生长、存活和运动相关的基因表达。

　　近来，许多研究报道了HER1/EGFR的三磷酸腺苷（ATP）结合袋的几种突变类型（例如缺失、错义编码）。耐人寻味的是，这些突变是在非小细胞肺癌患者肿瘤标本中发现的，说明基因突变是在肿瘤形成过程中发生的。这些患者正常肺组织中存在着野生型受体。HER1/EGFR突变型和野生型的细胞培养研究发现，突变型受体对天然的配体－EGF更为敏感。此外，已知的突变集中于酪氨酸激酶结构区的ATP结合裂口周围，侧翼的氨基酸是用来调节4-苯胺喹唑啉复合物（例如厄洛替尼、吉非替尼）。推测，关键氨基酸的复位可以稳定ATP和小分子TKI之间的相互作用。研究发现：临床上吉非替尼有效的大多数患者的肿瘤中存在HER1/EGFR ATP结合袋的基因突变。

　　实验室研究

　　一系列实验室研究的证据支持HER1/EGFR的失调能促进肿瘤生长、存活和进展的假设。这些证据包括：

　　·将EGFR转染到已培养好细胞株可导致肿瘤的发生
　　·当出现应激时，细胞内EGFR信号传导活性上调（例如，暴露于紫外线）
　　·HER1/EGFR在许多肿瘤中过度表达
　　·抑制HER1/EGFR可抑制体外肿瘤细胞的增殖和/或存活

　　概述：选择HER1/EGFR作为肿瘤靶点的机理

　　·HER1/EGFR的信号通路
　　－与正常组织相比，HER1/EGFR及其配体在实体肿瘤组织中有很高的水平共同表达
　　－肿瘤组织表达HER1/EGFR与临床疗效差相关
　　－HER1/EGFR信号传导的细胞学作用是细胞转化和肿瘤细胞的存活和进展
　　·HER1/EGFR分子
　　－在小鼠中，HER1/EGFR的基因失活导致严重异常，而去除TGF-α或双向调节因子影响不大（即，如果阻断一个特殊生长因子的活性，其它的配体分子可能上调）
　　－许多非小细胞肺癌肿瘤组织中，有HER1/EGFR激酶结构区突变。这些突变与肿瘤细胞对EGF过度敏感相关，因而促进肿瘤的发生
　　－由于HER2缺乏天然的配体，其磷酸化、细胞内信号传导、肿瘤进展等均依赖于异型二聚体化（主要和HER1/EGFR）

特罗凯^®的靶向作用机制