【摘要】  研究单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM₁）对帕金森病（PD）的治疗作用。运用选择性偏侧（右侧）PD大鼠模型，观测正常对照组、PD组（造模后14d）、PD生理盐水（NS）治疗组和GM₁治疗组（10mg/kg IP qd、连续14d），阿朴吗啡（APO）诱发的旋转行为改变和纹状体线粒体钙（MCa）、钙调素（CaM）含量改变。PD组表现明显的APO诱发的旋转行为（≥6r/min）,黑质损伤侧（右侧）纹状体MCa、CaM含量与正常对照组比较显著性升高（P＜0.01）。GM₁治疗组APO诱发的旋转行为明显好转，黑质损伤侧纹状体MCa、CaM含量与PD组比较无显著差异性（P＞0.05）。GM₁能改善实验性PD的部分行为、生化改变，对PD具有治疗作用。
【关键词】  GM₁；  帕金森病；  线粒体钙；  钙调素

帕金森病（Parkinson，s disease, PD）的主要病变是中脑黑质致密区中含黑色素的多巴胺（DA）能神经元严重缺失，黑质纹状体DA能神经通S路DA神经递质不足或缺乏，直接引发以锥体外系为主的症候；或继发中枢神经递质失调，与该递质密切相关的突触后受体受损，受体相关神经元损伤间接产生PD症候。本实验旨在通过观测GM₁对黑质DA能神经元严重缺失，导致纹状体失神经支配，纹状体DA受体超敏反应引起的APO诱发的旋转行为改变和PD模型中纹状体MCa、CaM含量改变的影响，研究探索GM₁对PD的治疗作用。

1   材料与方法
1.1  选择性偏侧大鼠PD模型制备
1.1.1  手术准备：成熟健康Wistar大白鼠，雌雄不拘，体重150~200g。动物在室温下笼中常规喂养，术前不禁食。6-羟多巴胺（6-OHDA·HBr，Sigma chemical Co.产品）溶于0.02%的抗坏血酸液中配成0.2%的溶液，低温（-20℃）冰箱中密封避光保存备用。阿朴吗啡（Apomorphine· HCl，APO，Sig- chemical Co.产品）用双蒸水配成0.01%溶液备用，以上溶液要求严格无菌。
1.1.2  选择性右侧偏侧大鼠PD模型制作[1,2]：动物用0.3%戊巴比妥钠10ml/kg腹腔注射麻醉后，固定在立体定位仪上（江湾I型C）。无菌条件下，正中切开大鼠颅顶部皮肤，剥离骨膜，暴露前囟（十字缝）、人字缝。用鼠颅骨钻于手术要求部位钻一直径为5mm的颅骨孔。参照Pellegrino等[3]大鼠脑立体定向图谱，参看Whishaw等（图谱附有）体重在150~200g范围内的鼠使用此图谱的数量折算方法。确定右侧黑质部坐标位置。用10μl微量进样器（上海计量仪器厂生产）分两次将6-OHDA按下列坐标位置注入右侧黑质部，建立右侧选择性大鼠PD动物模型。B坐标系统：外耳道连线（耳杆尖中心连线）低于上门齿板上缘5mm，即水平0平面。第一次注射4μl，针尖斜面朝嘴侧，坐标为，前囟后（Posterior bregma, PB）3.0mm，正中线右侧（Median right lateral .MRL）2.5mm，硬脑膜腹侧（Ventral dural, VD）8.6mm。第二次注射3μl，针尖斜面朝尾侧，坐标为PB2.4mm，MRL 2.7mm，VD8.6mm。注射速度1μl /min，每次注射完毕留针10min，然后以1.0mm/min速度缓慢拔针（约10min）。手术完毕，用医用明胶海绵堵塞颅骨孔，缝合切口，放回笼中喂养。
1.1.3  APO诱发动物旋转行为观察：造模术后14d，动物腹腔注射0.01% APO 10ml/kg诱发大鼠旋转行为（逆时针方向），验证6-OHDA对中脑黑质DA能神经元的损伤效应。旋转速度达到6r/min（Φ35 cm/r）视为成功PD选择性偏侧模型，注射APO 10min开始记录，共记录30min。

1.2  动物分组及处理
    实验动物分为正常对照组、PD组（≥6 r/min PD模型动物）、PDNS治疗组和GM₁治疗组（≥6 r/min PD模型动物，10mg/kg IP pd，连续14d），每组16例。按实验设计要求，于实验完毕时，记录APO诱发的旋转行为变化后，断头处死动物，快速取脑，在冰盘中分离右侧纹状体。测MCa的标本加入0.5N盐酸硝化24h，离心后取上清液0.2ml，加入1%La-Cl30.8ml混匀，用PE-503型原子吸光光度计（日本岛津公司产品）测钙浓度，另一份用Lowry氏法测线粒体蛋白浓度。测定CaM的标本先称湿重，然后用EDTA缓冲液（10mg/mg）匀浆，按刘景生等[4]磷酸二脂酶系统法测定。GM₁为意大利Fidia药厂产品，其余均为国产分析纯品。正常对照组除不行手术外，其余处理方法同上。

1.3  统计学处理
数据以均数±标准差x±s表示。组间比较采用t检验，检验水准α=0.05。


2  结果
PD组表现明显的APO诱发的旋转行为（≥6 r/min）。黑质损伤侧（右侧）纹状体MCa、CaM含量（MCa 14.44±2.11，CaM38.81±5.22）与正常对照组（MCa 7.26±1.32，CaM22.29±1.79）比较显著升高（P＜0.01＝；GM₁治疗组APO诱发的旋转行为明显好转（治疗前7.18±1.03，治疗后2.05±0.53），黑质损伤侧纹状体MCa、CaM含量（MCa 7.21±1.30，CaM22.31±1.81）较PD组显著性下降（P<0.01）；NS治疗组ATP诱发的旋转行为和黑质损伤侧纹状体MCa、CaM含量与PD组比较无显著差异（P>0.05），见表1、2。



3  讨论
3.1  MCa、CaM与神经元损伤的关系
研究[5.6]表明MCa、CaM是衡量细胞内外Ca2+平衡的良好指标，MCa、CaM含量升高间接说明细胞内外Ca2+平衡紊乱发生。细胞内外Ca2+平衡紊乱对神经元的损失作用主要有以下几个方面[7-9]：①细胞外Ca2+大量内流入细胞内引发Ca2+超载，Ca2+在线粒体积聚引起水肿，ATP合成障碍，破坏氧化磷酸化；②激活细胞浆活性酶（蛋白水解酶，磷脂酶）产生细胞毒性损伤////////Ca2+·CaM复合物），使细胞结构破坏、崩解；③在细胞核内积聚，激活核酶使DNA断裂，染色体聚集、固缩。这些损伤过程最终导致神经元变性、坏死。

3.2  GM₁对PD治疗作用的探讨
实验结果显示：外源性GM₁能明显降低实验性PD纹状体MCa、CaM 含量，减轻APO诱发的旋转行为。说明外源性GM₁能阻抑实验性PD发病过程中黑质一纹状体系统Ca2+平衡紊乱的发生，改善纹状体DA受体因失神经支配而呈现的超敏反应状态，对PD具有治疗作用。实验中运用的GM₁为动物脑中提取的纯GM₁，毒副反应很低。发挥PD治疗作用的机制可能有：①外源性GM₁对Ca2+有高度亲和力，可减少Ca2+内流，减轻或阻止细胞内外Ca2+平衡紊乱发生，从而使MCa、CaM含量降低，保护神经细胞免受损伤[10]；②外源性GM₁能保护黑质细胞，促使触索芽生进入纹状体内，增强酪氨酸羟化酶的纤维网的再生，并能加速纹状体DA代谢的恢复，改善纹状体DA受体超敏状态，减轻APO诱发的旋转行为[11]；③GM₁还具有神经营养作用和GNS修复作用[12]；以上GM₁作用可能直接或间接发挥PD治疗作用。


参考文献
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