肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率增长最快，预后最差的恶性肿瘤之一，虽然近年来化疗、放疗和手术方法不断发展，但肺癌患者总的5年生存率仍没有得到明显的改善，随着分子生物学理论和技术的飞速发展，肺癌的基因治疗备受瞩目并取得了令人振奋的结果。肺癌基因治疗的策略主要包括：替代缺陷的抑癌基因、灭活癌基因、引入自杀基因、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗、肿瘤血管基因治疗等方面。本文对此作一介绍。        一、替代缺陷的抑癌基因 　　抑癌基因的失活与肿瘤的生长密切相关，将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以补偿和代替突变或缺失的抑癌基因，从而达到抑制肿瘤生长或逆转其表型的基因治疗方法即为抑癌基因替代治疗。目前已证实，肺癌中常见失活的抑癌基因有p53、Rb和P16，其中p53基因在肺癌基因治疗研究中最为活跃。肺癌中p53基因的突变率达50%~70%，此外，即使在无p53基因突变的肺癌中，p53基因因为结合了高水平的MDM2蛋白而无活性，或因其下游基因如抗凋亡基因Bcl-2家族使p53基因功能发生变化或无活性转录而出现功能性失活[1]。p53基因在参与细胞周期调控，诱导细胞凋亡的过程中发挥着关键性的作用。早期临床前研究显示，p53基因替代治疗可抑制p53基因突变的人肺癌细胞的生长，而p53基因功能正常的细胞不受影响。转导p53基因常用的载体有腺病毒载体和逆转录病毒载体，Roth等首先报道用逆转录病毒作为载体转导野生型p53基因瘤内注射治疗9例非小细胞肺癌患者的临床试验，尽管RT-PCR证实基因转移成功，3例患者肿瘤消退，3例患者肿瘤稳定，但由于逆转录病毒能整合到宿主基因组中，只感染增殖期细胞，病毒滴度低，而腺病毒没有这些缺点，它不能被整合到宿主基因组中，感染不依赖细胞周期，既感染增殖细胞也感染非增殖细胞，转导效率高，宿主范围广，因而腺病毒载体成为临床试验中最常用的病毒基因转移系统[2]。 　　Zhang等[3]用一种重组腺病毒载体介导p53基因（Ad-p53）转染人非小细胞肺癌（NSCLC）H358细胞,测定结果显示p53蛋白在H358中高水平表达，用在体外被Ad-p53转染过的H358细胞注入小鼠体内，没有小鼠生长肿瘤，而注入没有被Ad-p53转染过的对照组，有80%的小鼠发生了肿瘤。Osaki等[4]用Ad-p53转染人肺鳞癌细胞NCI-H157和NCI-H1299，同时联合应用化疗药物DDP、5-Fu、CPT-11等的体外、体内试验结果显示，Ad-p53与DDP、5-Fu和CPT-11有明显协同抗肿瘤效应。Horio 等[5]用Ad-p53联合治疗NSCLC的常用化疗药物包括Docetaxel、Paclitaxel、DDP、VP-16等对7种不同内源p53基因状况的NSCLC细胞株的作用观察到，Ad-p53能增加肺癌细胞对化疗的敏感性，促进细胞凋亡，Ad-p53与化疗药物的协同抗肿瘤效应不受内源性p53状况的影响。Kawabe等[6]报道了Ad-p53能明显增加NSCLC细胞的放疗敏感性，并不受内源性p53状况的影响。国内徐敏毅等[7]采用Ad-p53联合化疗药物DDP、三氧化二砷对人肺腺癌细胞株GLC-82（含突变型 p53基因）的体内、外实验观察到，Ad-p53能显著增强人肺腺癌GLC-82细胞的化疗敏感性。 　　由国内研制的世界首个基因治疗药物“重组人p53腺病毒注射液”（今又生/Gendicine）单药或联合放疗对头颈鳞癌患者的治疗中，取得了非常好的临床疗效。自2004年9月起我院肿瘤中心与深圳市赛百诺基因公司的科研合作项目重组人p53腺病毒注射液（今又生）联合化疗治疗肺癌的实验研究及临床疗效观察已取得了阶段性结果，我们应用重组人腺病毒载体所携带的野生型p53基因导入人肺腺癌细胞株GLC-82（含突变型p53基因）及A549（含野生型 p53基因），并联合应用化疗药物顺铂，通过Western blot 法分析外源野生型p53基因在细胞内的表达，MTT法和流式细胞术观察对细胞生长抑制及细胞周期、凋亡的影响。结果显示，外源p53基因能在GLC-82及A549细胞中高效表达，表达强度呈时间依赖性，剂量依赖性（资料未显示）。重组人p53腺病毒注射液对肺癌细胞的抑制作用呈时间依赖性，剂量依赖性效应，与外源p53基因在细胞中的表达强度相一致（资料未显示）。100MOI（multiplicity of infection，感染复数）的重组人p53腺病毒注射液与顺铂0.5mg/L联合应用后72h，对A549细胞生长的抑制率达43.13%（单用的抑制率分别为23.44%、14.17%），差异有显著性（P﹤0.05）；对GLC-82细胞生长的抑制率达63.73%（单用的抑制率分别为41.51%、56.11%），差异有显著性（P<0.05）。重组人p53腺病毒注射液与顺铂联合应用能使细胞阻滞于G0/G1期，S期细胞比例明显减少，引起的A549细胞凋亡率为28.99%（单用的凋亡率分别为15.35%、1.74%），GLC-82细胞凋亡率为62.98%（单用的凋亡率分别为20.88%、6.91%），差异均有显著性（P<0.05）（资料未显示）。研究结果表明，p53基因替代治疗可以明显提高肺腺癌细胞的化疗敏感性，p53基因治疗联合化疗对含突变型 p53基因及含野生型 p53基因的肺腺癌均有很好的疗效，这为基因药物“重组人p53腺病毒注射液”（今又生）用在肺癌临床研究中提供了一定的理论依据。 　　国外重组腺病毒p53基因治疗肺癌的临床研究也取得了令人振奋的结果。 Swisher等[8]对28例NSCLC病人在CT引导或支气管镜下给予瘤内注射Ad-p53治疗，剂量为106~1011 PFU，1次/月，共治疗6次。结果显示，p53mRNA在26例病人肿瘤组织中有12例表达，可评价者25例，2例病人肿瘤达到部分缓解，16例病人肿瘤保持稳定2~14个月，治疗的毒性反应轻微，包括局部注射部位疼痛、一过性发热（常见）、轻度咯血（少数支气管镜下注射病人），没有过敏反应及其它毒性反应的发生。Nemunaitis等[9]选择24例晚期NSCLC病人，给予梯度剂量的Ad-p53联合顺铂治疗，Ad-p53瘤体内注射，剂量为106~1011PFU/次，d4，顺铂 80mg/m2 iv d1, 每28天1周期，共治疗6个周期，23例可评价病人中有2例肿瘤获得部分缓解，17例病人疗效稳定，4例病情进展，有8例病人出现短暂的自限性发热，化疗相关性毒性没有增加，43%可评价病人肿瘤内检测到外源性p53基因表达。Carbone等[10]采用支气管内直接滴注Ad-p53，剂量为2×109VP（virus particle，病毒颗粒）、2×1010VP、2×1011VP、5×1011VP、或2×1012VP，治疗25例支气管肺泡癌，2周内接受2次滴注为1个治疗周期，每次只针对单个受累肺叶。除2×1012VP剂量组的4个病人中有1例发生4度肺部毒性，1例在完成第2周期约1月后死亡外，其他23例均安全。25例中可评价者24例，其中1例肿瘤部分缓解，17例肿瘤停止生长。Schuler等[11]将Ad-p53与以铂类为基础的一线化疗方案联合应用治疗25例Ⅲ/Ⅳ期NSCLC病人，治疗方案A组：Carboplatin AUC 6 d1+ Paclitaxel 175 mg/m2 d1；B组：DDP100 mg/m2 d1+NVB25 mg /m2 d 1、8、15、22联合瘤体内注射7.5×1012 VP的Ad-p53 d1，共进行了68个周期的治疗，20个病人做完了3个以上周期的治疗，结果显示：两组总的疗效（基因治疗联合化疗组52%，单纯化疗组48%）和生存期无显著差异，基因治疗联合化疗可以促进肿瘤消退，68%的病人肿瘤组织中表达外源性p53基因。 Swisher等[12]应用Ad-p53联合放疗治疗19例不适合行手术或化、放疗的非转移性NSCLC，瘤内注射Ad-p53 d1、18、32，剂量为7.5 × 1012 VP，同时接受一个疗程的放疗，剂量为60Gy，治疗完成后3个月进行原发灶病理活检显示，63%（12/19）的病人病理活检阴性，而单独放疗病理阴性率不到20%。进行CT和支气管镜检查发现，5%（1/19）的病人肿瘤完全缓解，58%（11/19）的病人肿瘤部分缓解，16%（3/19）的病人肿瘤停止生长，2例不能评价疗效，可评价病人的有效率达71%。RT-PCR定量分析检测肿瘤组织中4个与p53相关的基因p21、Fas、BAK和MDM2表达都增高，说明外源性p53基因导入肿瘤组织后发挥了生物学效应。最常见的毒性反应为Ⅰ～Ⅱ度发热和寒战。以上临床试验结果可以看出，重组腺病毒介导的外源性p53基因能在肿瘤局部有效表达，产生抗肿瘤效应，与放、化疗联用未增加放、化疗的毒性反应，能增加放疗的临床疗效，联合化疗可以促进肿瘤消退。此外，美国Scott等学者正在进行卡铂化疗后应用树突状细胞联合Ad-p53作为肿瘤疫苗免疫治疗小细胞肺癌(SCLC)的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，研究结果尚未公布。 　　此外，重组腺病毒p53基因治疗头颈鳞癌、乳腺癌、卵巢癌等的临床试验也同样取得了令人鼓舞的结果。 　　除野生型p53基因替代治疗外，还有一种靶向于突变p53基因的复制选择性腺病毒Onyx-015，因腺病毒的E1B-55KDa基因产物能与野生型p53结合，使p53抑制和/或降解，根据这个原理，将E1B-55KDa基因除去的腺病毒Onyx-015，不能灭活正常细胞的p53和在其中复制，而肿瘤细胞缺乏正常p53功能，复制能进行，结果致细胞裂解死亡，又称溶瘤病毒。但近来有一些报道发现Onyx-015也能在含野生型p53的细胞中复制，相对于在肿瘤细胞中，它的复制效率要低得多。国外Onyx-015已用于结直肠癌、胃肠道肿瘤肝转移、卵巢癌等多种肿瘤的临床Ⅰ/Ⅱ期试验，取得了较好的疗效[13]。国内上海三维生物技术有限公司类似于Onyx-015溶瘤病毒H101也已进入Ⅲ期临床试验。 　　p16基因是另一个研究较多的抑癌基因，它对细胞周期G1期有特异性调节作用。用构建含有p16INK4cDNA表达载体转染p16INK4基因缺失的肺癌细胞Calu-6，可有效地抑制癌细胞克隆的形成。Craig等[14]用腺病毒介导的p16基因替代治疗可抑制p16基因缺失的肺癌细胞株的生长。美国MD Anderson癌症中心的研究人员将p16基因载体直接注入NSCLC细胞的裸鼠移植瘤中，发现肿瘤的生长得到了有效抑制。Kawabe 等[15]研究发现，将腺病毒介导的野生型p16 INK4a基因导入有野生型p53基因而无p16基因功能的肺癌细胞后，肿瘤细胞的放疗敏感性明显增加。此外，研究发现，p16基因与p21基因、p53基因之间有协同作用，p16基因与p21基因以及p16基因与p53基因联合转导的抗肿瘤效应好于p16基因单独转导。 　　抑癌基因Rb编码一种核磷酸蛋白，可调节细胞G0/G1期到S期交界处的控制点。Rb基因在大多数小细胞肺癌（SCLC）和20%NSCLC中发生突变。Antelman等[16]将功能型Rb基因转染到有Rb基因缺失的肺癌细胞中，细胞的生长受到了抑制。 　　另外，抑癌基因p21、p27、FHIT、MDA-7替代的临床前研究也表明能抑制肿瘤细胞的生长。        二、灭活癌基因 　　癌基因的活化在肺癌的发生、发展中起着至关重要的作用。肺癌中常见的异常癌基因有K-ras、myc、bcl-2、Her-2/neu等，当这些基因改变时，就会导致基因异常活化而启动细胞生长，从而发生恶性转化。将癌基因反义序列导入癌细胞使之封闭，可阻止癌细胞的生长。在1/3的肺腺癌中有K-ras基因的突变，K-ras基因的突变与预后差有关。Mukhopadhyay等[17]用含K-ras反义序列的重组质粒转染K-ras突变的肺癌细胞H460a，结果H460a细胞内的突变K-ras mRNA的翻译明显受到抑制，发生了3倍的癌细胞生长抑制，而H-ras 和N-ras的表达没有变化。Alemany等[18]以腺病毒为载体将反义的K-ras导入肺癌细胞H460a（K-ras 61位突变）和H358（K-ras 12位突变）中，发现细胞内反义K-ras能高水平表达，K-ras蛋白的表达显著降低，细胞生长明显受抑；同样的方法导入肺癌细胞H322（表达野生型K-ras）中，细胞生长却没有影响。此外，针对癌基因的核酶（Ribozyme，RZ）技术研究也甚多，主要因为RZ能够序列特异性地抑制靶mRNA，区别正常的癌基因和突变型癌基因。Zhang等[19,20]应用针对突变型K-Ras癌基因锤头状RZ，体内外试验中观察到均能显著抑制K-ras基因突变的肺癌细胞生长。Funato等[21]发现K-Ras RZ除了抑制肿瘤的生长外，还能增强肿瘤对化疗药物如DDP、5-FU、VP-16等的敏感性。       在绝大多数的SCLC中有myc基因的过度表达。Wei等[22]发现用反义myc（片段构建）重组腺病毒载体Ad-As-myc能显著抑制肺腺癌GLC-82和SPC-A-1细胞生长和克隆形成，并诱导其凋亡。RT- PCR和Western印迹显示myc基因表达下降，凋亡相关基因Bcl-2和Bax分别出现下调和上调。瘤内注射Ad-As-myc可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长（抑瘤率为52%）。应用myc反义寡聚脱氧核苷酸也可有效抑制肺癌细胞中myc基因的表达，从而抑制肺癌的生长。研究表明，myc反义寡聚脱氧核苷酸不但可有效地抑制SCLC细胞的生长，对NSCLC细胞也有一定的抑制作用。 　　bcl-2基因过表达见于大多数的NSCLC及SCLC。bcl-2基因是一种抗凋亡的癌基因，经基因激活或扩增而引起过表达。bcl-2基因的过表达可使肿瘤细胞对细胞毒性药物的耐受性增加，敏感性下降。临床前期研究表明，通过抗凋亡基因bcl-2的反义灭活或腺病毒转导促凋亡基因，使bcl-2家族成员失调，可明显地杀死肿瘤细胞[23]。 　　HER-2/neu 基因编码的蛋白与表皮生长因子受体（EGFR）非常相似，是肽类激素受体，当在细胞表面表达上调时，能促进肿瘤生长。该基因的变异方式主要是基因扩增和RNA及蛋白质的过度表达。研究发现，虽然HER-2/neu 基因的表达在乳腺癌中较肺癌中常见，但是仍有1/3以上的NSCLC中存在HER-2/neu的高表达，HER-2/neu的高表达与NSCLC的预后差、降低生存有关。针对HER-2/neu受体的反义DNA复合物的体外试验显示能抑制肿瘤细胞生长[23]。抗HER-2/neu 的单克隆抗体赫赛汀（Herceptin）已成功治疗了转移性乳腺癌，Ⅱ期临床试验已初步表明，Herceptin能有效治疗NSCLC，与其它化疗药物联用能增加化疗药的疗效，毒副反应未增加。目前正在进行的Ⅲ期临床试验将对Herceptin单药及联合其它化疗药物治疗NSCLC的临床疗效作出最后的结论。       三、引入自杀基因 　　引入自杀基因就是将某些细菌、病毒和真菌中特有的药物敏感基因导入肿瘤细胞，通过此基因编码的特异性酶类将原先对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成有毒性的产物，以达到杀死肿瘤细胞的目的，自杀基因也称药物敏感基因（Drug sensitive gene）。常用的自杀基因包括：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷（HSV-tk/ GCV）、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因(VZV-tk)、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因（CD）、细胞色素P-450基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（GPT）等。HSK-tk/GCV是最常用的自杀基因系统，它编码胸苷激酶，该酶可将核苷类似物（NA）代谢为二磷酸化物，后者在细胞内酶的作用下成为有毒性的三磷酸化物而发挥抗肿瘤作用。自杀基因CD的研究也很广泛。CD基因编码胞嘧啶脱氢酶，可将胞嘧啶代谢为尿嘧啶，使无毒的氟胞嘧啶（5-FC）转化为具有细胞毒性和抗代谢活性的5-氟尿嘧啶（5-Fu），阻碍肿瘤细胞DNA合成和mRNA翻译。该基因只在真菌、细菌中存在，哺乳动物中不含此种酶。 　　研究发现，几乎所有的自杀基因系统都具有旁观者效应 (Bystand effect)，能对邻近非转导细胞产生细胞毒作用，其机制可能与细胞间缝隙连接有关，这是自杀基因治疗的重要特征，明显扩大了自杀基因的作用范围。 Morimoto等[24]用胃泌素释放肽（GRP）启动子调控的腺病毒介导的HSV-tk基因在体外转导人SCLC细胞株SBC5，结果发现SBC5细胞对GCV的敏感性大大增加，在体内实验中裸鼠的肺癌完全消退。Song等[25]在体外研究中将用myc基因最大反应元件、端粒酶催化亚基启动子和肉瘤病毒40增强子调控的腺病毒介导的HSV-tk基因转导到SCLC细胞中，能引起细胞明显的抑制和凋亡，此系统只靶向于端粒酶及myc基因都高表达的SCLC细胞，引起特定细胞的死亡，对正常细胞无影响。这是利用肿瘤特异性调控元件去调节自杀基因的表达，这些特定的转录调控元件在正常细胞中不存在。因此，当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制的外源性目的基因后，肿瘤细胞内的特异调控序列可被激活，表达目的基因，从而达到靶向基因治疗的目的，而正常细胞无损伤。        四、免疫基因治疗 　　免疫基因治疗的具体策略是通过基因工程的方法将目的基因导入肿瘤细胞或效应细胞，然后将表达目的基因的受体细胞输入到患者体内，通过提高人体免疫系统对肿瘤细胞的认识、抑制或杀伤能力，对肿瘤进行治疗。目前免疫基因治疗的方法主要有针对免疫应答细胞和针对肿瘤细胞的免疫基因治疗。 　　针对免疫应答细胞的免疫基因治疗常用的免疫细胞有两种：免疫效应细胞和树突状细胞。免疫效应细胞介导的基因治疗是将细胞因子导入抗肿瘤效应细胞中以增强抗肿瘤作用，并以免疫效应细胞为载体细胞将细胞因子基因携带至体内靶细胞，使细胞因子局部浓度提高，从而更有效地激活肿瘤局部及周围的抗肿瘤免疫功能。常用的免疫效应细胞有TIL、CTL、LAK、Mφ、NK等，可供选择的目的基因有白介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子等。在这些目的基因中，以IL-2的研究为最多。Tam 等[26]根据NK细胞的杀伤活性及扩增能力等依赖于IL-2的特点，将IL-2基因转染至一株对多种肿瘤细胞具有杀伤作用的人NK细胞株NK-92（依赖外源IL-2），构建了不再依赖外源的新型NK细胞株NK-92MI（高表达IL -2）及 NK-92CI（低表达IL-2），发现NK-92MI及NK-92CI对白血病细胞株K562的杀伤活性与NK-92相比无显著差异，也不影响正常的造血前体细胞的功能。Basse等[27]的研究发现IL-2激活的NK细胞可以选择性地聚集在某些实体瘤组织细胞中起到杀伤作用。Tan等[28]用逆转录病毒载体转导IL-2基因到肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）对10例传统治疗无效的肺癌癌性胸水患者进行治疗，6例患者在超过3周时间内无胸腔积液积累，1例不仅无胸腔积液，CT发现肺部原发病灶消失，在整个治疗期间无明显毒性反应，仅有轻微发热，表明IL-2基因转染治疗癌性胸腔积液有效而安全。 　　树突状细胞（DC）是人体最有效的抗原递呈细胞（APC），能致敏和激活静止T细胞和B细胞。T细胞直接或通过分泌细胞因子，B细胞通过分泌抗体，作用于靶细胞或病原体上，最终消灭靶细胞或病原体。Nair等[29]用人肺转移癌细胞中提取的总RNA，负载自体DC细胞,再将此细胞注射回患者，在患者体内诱导产生了肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞。Mariani等[30]在体外将表达人IL-7cDNA的重组腺病毒转导DC细胞，然后与GM-CSF和IL-4培养一周后，注入裸鼠移植Lewis肺癌瘤内，结果注射肿瘤明显消退，对侧未注射肿瘤也发生消退，IL-7转导DC细胞的作用比单独DC细胞或IL-7作用更有效，在注射肿瘤和对侧未注射肿瘤中均能检测到IL-7的产物和INF-γ。 肿瘤之所以能逃脱机体的免疫系统，就是因为其本身的弱免疫原性，而且在抗原递呈过程中还存在多个环节的缺陷。针对肿瘤细胞的免疫基因治疗就是将细胞因子和免疫相关基因导入肿瘤细胞，制备各种瘤苗以增强机体的抗肿瘤免疫功能。Kikuchi等[31]将共刺激分子CD40基因的重组腺病毒直接注入小鼠黑色素瘤、结肠癌及Lewis肺癌等实体瘤内，发现60%以上的小鼠黑色素瘤及结肠癌得以治愈，而免疫原性极弱的Lewis肺癌也有部分治愈。Marian等[30]将在体外被腺病毒载体介导GM-CSF转染18小时的自体手术切除肿瘤组织制成细胞疫苗注入NSCLC患者体内，每两周一次，共注射6次。结果33例Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者中有3例完全缓解（其中2例为细支气管肺泡癌），6例肿瘤稳定，疫苗效应显示剂量依赖效应，GM-CSF剂量＞40ng/百万细胞/24h的患者中位生存期为17个月，而GM-CSF剂量＜40ng/百万细胞/24h的患者中位生存期仅为7个月，这个试验显示，对肿瘤患者制造自体疫苗治疗的方法是可行的。        五、多药耐药基因治疗 　　多药耐药（Mulitiple Drug Resistance，MDR）是指肿瘤细胞长期接触某一种化疗药物，不仅对此种化疗药物产生耐药，而且对其它结构和功能不同的多种药物产生交叉耐药性。这种耐药性由基因控制，即多药耐药基因MDR或多药耐药相关蛋白基因MRP放大或过表达，MDR分为MDR1和MDR2，其中MDR1与细胞的多药耐药有关。MDR1基因表达产物为分子量170KD的P-糖蛋白（P-gp），它是一种细胞膜上依赖ATP的药物外排泵，能将进入细胞内的药物泵出细胞外，导致细胞内药物浓度不断降低，其细胞毒作用因而减弱甚至丧失，最终出现耐药现象。因此，逆转肿瘤细胞的耐药性对提高化疗效果是非常重要的。多药耐药基因治疗有两种方法：一种是应用反义RNA技术，以抑制异常活化的MDR1或MRP基因，从而达到逆转肿瘤细胞化疗耐药的作用；另一种是将MDR1基因导入造血干细胞，获表达后可使骨髓细胞产生对化疗药物的抗性，抵御化疗药物的损害，从而达到增加化疗药物剂量，进而提高化疗疗效的目的。 　　Gao等[32]用逆转录病毒载体介导反义MDR1、MRP RNA转导入经阿霉素选择的多药耐药肺癌细胞GAOK，流式细胞仪分析转染后MDR1、MRP两基因蛋白表达明显被抑制，分别减少64%、93%，MTT法分析药物抵抗性表明对阿霉素、顺铂、长春新碱分别减少99%、98%、97%。Stewart等[33]合成一段与MRP mRNA互补的16个碱基寡核苷酸对MRP高表达的一株SCLC细胞进行转染，结果发现经过基因打靶后细胞MRP mRNA表达水平只有原先的10%，细胞的耐药性明显下降。Marthinet[34]通过合成针对人类MDR1为目的基因的反义质粒，成功地逆转了对长春新碱等多种药物耐药的肿瘤细胞系P-gp的过度表达。       六、肿瘤血管基因治疗 　　肿瘤血管生成是肿瘤发生、发展的必要条件，也是所有实体肿瘤的共性。肿瘤血管发生是血管生成促进因子和血管生成抑制因子失衡的结果。肿瘤血管生成促进因子主要有血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板相关生长因子（PDGF）等，其中以VEGF最为重要，VEGF是肿瘤诱导血管生成过程中一个主要的调节因子，它可选择性刺激内皮细胞分裂，并能增加微血管的通透性，许多血管生成促进因子都是通过诱导VEGF的表达来实现对血管生长的调控。因而抗血管生成基因治疗中VEGF是比较理想的靶分子，通过阻断VEGF的翻译和转录过程可使它的产生受到抑制。针对VEGF蛋白的一种治疗方法是引入一段反义VEGF的cDNA基因，通过与 VEGF的mRNA结合，来抑制VEGF蛋白的翻译，应用VEGF反义核酸在裸鼠上进行实验，发现VEGF反义核酸技术能有效下调肿瘤细胞VEGF表达，抑制肿瘤血管形成；另一种治疗方法是利用反义RNA的RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术。针对VEGF的单抗Bevacizumab（AvastinTM）可以直接封闭VEGF，ECOG正在进行Bevacizumab联合化疗治疗晚期除肺鳞癌以外的NSCLC的Ⅲ期临床试验。除此以外，将腺病毒介导的野生型p53基因导入有p53突变的NSCLC患者体内，也可以明显地抑制VEGF的表达[35]。       除了VEGF外，还有两个常用的血管生成抑制因子：血管抑素（angiostatin）和内皮抑素（endostatin）。Sauter等[36]研究了腺病毒介导的endostatin基因对裸鼠异体移植Lewis肺癌的作用，发现Lewis肺癌减小了78%，而且用endostatin载体进行治疗可防止肿瘤在肺内的微小转移。       七、结语 　　基因治疗作为一种新的治疗手段，初步研究结果证实对肺癌单用已取得较理想的疗效， 联合常规放、化疗可增强肺癌治疗的整体疗效。可以预期，随着对肿瘤发病分子机制的深入阐明，基因治疗技术的不断提高，基因治疗必将在肺癌临床治疗中发挥越来越重要的作用。 参考文献 [1] Swisher SG, Roth JA. p53 Gene therapy for lung cancer. Curr Oncol Rep, 2002, 4(4):334-340. [2] Vorburger SA, Hunt KK. Adenoviral gene therapy. Oncologist, 2002, 7:46-59. [3] Zhang WW, Fang X, Mazur W, et al. High efficiency gene transfer and high-level expression of wild-type p53 in human lung cancer cells mediated by recombinant adenovirus.Cancer Gene Ther ,1994,1(1):5-13. [4] Osaki S, Nakanishi Y, Takayama K, et al. Alteration of drug chemosensitivity caused by the adenovirus- mediated transfer of the wild-type p53 gene in human lung cancer cells. Cancer gene Ther, 2000,7(2):300- 307. [5] Horio Y，Hasegawa Y，Sekido Y，et al. Synergistic effects of adenovirus expressing wild-type p53 on chemosensitivity of non-small cell lung cancer cells. Cancer Gene Therapy,2000,7(4):537-544. [6] Kawabe S, Munshi A, Zumstein LA, et al. Adenovirus-mediated wild-type p53 gene expression radiosensi- tizes non-small cell lung cancer cells but not normal lung fibroblasts. Int J Radiat Biol, 2001,77(2): 185-194. [7] 徐敏毅, 林 晨, 梁 萧, 等. 基因治疗与化疗联合应用对人肺腺癌GLC-82细胞作用的实验研究. 中华医学杂志, 2000,80(9):689-693. [8] Swisher SG, Roth JA, Nemunaitis J, et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in advanced non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst,1999, 91(9):763-771. [9] Nemunaitis J, Swisher SG, Timmons T, et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in sequence with cisplatin to tumors of patients with non-small cell lung cancer. J Clin Oncol,2000, 18(3):609-622. [10] Carbone DP, Adak K, Schiller J, et al. Adenovirus p53 administered by bronchoalveolar lavage in patients with bronchioalveolar cell lung carcinoma (BAC).Proc Am Soc Clin Oncol, 2003,22:620(abstr 2492) [11] Schuler M, Herrmann R, De Greve JL,et al. Adenovirus-mediated wild-type p53 gene transfer in patients receiving chemotherapy for advanced non-small-cell lung cancer: results of a multicenter phase II study. J Clin Oncol,2001,19 (6): 1750-1758. [12] Swisher SG, Roth JA, Komaki R, et al. Induction of p53-regulated genes and tumor regression in lung cancer patients after intratumoral delivery of adenoviral p53 (INGN 201) and radiation therapy. Clin Cancer Res, 2003, 9:93-101. [13] McNeish IA, Bell SJ, Lemoine NR. Gene therapy progress and prospects: cancer gene therapy using tumour suppressor genes. Gene Ther,2004,11(6):497-503. [14] Craig C, Kim M, Ohri E, et al. Effects of adenovirus-mediated p16INK4A expression on cell cycle arrest are determined by endogenous p16 and Rb status in human cancer cells. Oncogene,1998 ,16(2):265-272. [15] Kawabe S, Roth JA, Wilson DR, et al. Adenovirus-mediated p16INK4a gene expression radiosensitizes non-small cell lung cancer cells in a p53-dependent manner. Oncogene, 2000,19(47):5359-5366. [16] Antelman D, Machemer T, Huyghe BG, et al. Inhibition of tumor cell proliferation in vitro and in vivo by exogenous p110RB, the retinoblastoma tumor suppressor protein. Oncogene,1995 ,10(4):697-704. [17] Mukhopadhyay T, Tainskym Cavender AC, Roth JA. Specific inhibition of  K-ras expression and tumorigenicity of lung cancer cells by antisense RNA. Cancer Res,1991, 51(6)1744-1748. [18] Alemany R, Ruan S, Kataoka M, et al.Growth inhibitory effect of anti-K-ras adenovirus on lung cancer cells. Cancer Gene Ther,1996, 3(5)296-301. [19] Zhang YA, Nemunaitis J, Tong AW. Generation of a ribozyme-adenoviral vector against K-ras mutant human lung cancer cells.Mol Biotechnol,2000, 15(1):39-49. [20] Zhang YA, Nemunaitis J, Scanlon KJ, et al. Anti-tumorigenic effect of a K-ras ribozyme against human lung cancer cell line heterotransplants in nude mice. Gene Ther, 2000 ,7(23):2041-2050. [21] Funato T, Ishii T, Kambe M, et al. Anti-K-ras ribozyme induces growth inhibition and increased chemosensitivity in human colon cancer cells. Cancer Gene Ther, 2000 ,7(3):495-500. [22] Wei Y, Lin C, Zhang X. Adenovirus-transferred antisense c-myc selectively induces tumor cell cycle arrest and apoptosis. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 1999,79(8):617-620. [23] Daniel JC, Smythe WR. Gene therapy of lung cancer. Semin Surg Oncol, 2003,21(3):196-204.23  [24] Morimoto E, Inase N, Mlyake S, et al. Adenovirus-mediated suicide gene transfer to small cell lung carcinoma using a tumor-specific promoter. Anticancer Res,2001,21(1A):329-331.. [25] Song JS. Adenovirus-mediated suicide SCLC gene therapy using the increased activity of the hTERT promoter by the MMRE and SV40 enhancer. Biosci Biotechnol Biochem,2005 ,69(1):56-62. [26] Tam YK, Maki G, Miyagawa B, et al. Characterization of genetically altered, interleukin 2-independent natural killer cell lines suitable for adoptive cellular immunotherapy. Hum Gene Ther,1999,10(8):1359- 1373. [27] Basse PH, Whiteside TL, Herberman RB. Cancer immunotherapy with interleukin-2-activated natural killer cells.Mol Biotechnol., 2002 ,21(2):161-170. [28] Tan Y, Xu M, Wang W, et al. IL-2 gene therapy of advanced lung cancer patients. Anticancer Res, 1996, 16(4A):1993-1998. [29] Nair SK, Morse M, Boczkowski D, et al. Induction of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfected dendritic cells. Ann Surg,2002 ,235(4):540-549. [30] Mariani SM. Conference report--gene therapy and lung cancer--no time to wait. MedGenMed, 2004, 16, 6(3): 21. [31] Kikuchi T, Crystal RG. Anti-tumor immunity induced by in vivo adenovirus vector-mediated expression of CD40 ligand in tumor cells. Hum Gene Ther, 1999,10(8):1375-1387. [32] Gao Z, Gao Z, Fields JZ, et al. Co-transfection of MDR1 and MRP antisense RNAs abolishes the drug resistance in multidrug-resistant human lung cancer cells. Anticancer Res,1998 ,18(4C):3073-3076. [33] Stewart AJ, Canitrot Y, Baracchini E, et al. Reduction of expression of the multidrug resistance protein (MRP) in human tumor cells by antisense phosphorothioate oligonucleotides. Biochem Pharmacol, 1996, 23, 51(4): 461-469. [34] Marthinet E, Divita G, Bernaud J, et al. Modulation of the typical multidrug resistance phenotype by targeting the MED-1 region of human MDR1 promoter. Gene Ther,2000 ,7(14):1224-1233. [35] Fujiwara T, Nishizaki M, Tanaka N. Recombinant adenovirus expressing wild-type p53 is antiagiogenic--implication for lung cancer gene therapy. Gan To Kagaku Ryoho,2000 ,27(8):1217-1224. [36] Sauter BV, Martinet O, Zhang WJ. Adenovirus-mediated gene transfer of endostatin in vivo results in high level of transgene expression and inhibition of tumor growth and metastases.Proc Natl Acad Sci USA. 2000, 25,97(9):4802-4807.