[摘　要] 　
乙型肝炎(乙肝)是严重威胁人类健康的疾病之一。目前用于临床的乙肝治疗药物主要有抗病毒药、免疫调节药和肝功能恢复和调节药等。慢性乙肝的治疗,目前尚存在疗效不够满意、复发率高、许多抗病毒药物在达到治疗剂量时对人体亦产生细胞毒性和药价昂贵等问题。所以,抗乙型肝炎病毒(HBV)药物的研究任重道远。这迫切需要对乙肝治疗药物的应用的充分了解以及对更有效药物的开发思路的探索。

全世界有3. 5亿～4. 0亿乙型肝炎病毒(HBV)感染者,其中每年有近100万患者死于HBV感染引起的肝硬化和肝癌[ 1 ] 。在我国有1亿之多HBV感染者,占世界总数的1 /3以上,居世界第1位,其中慢性乙型肝炎(乙肝)患者3 000万例。我国每年有近30万患者死于因乙肝诱发的病变,这个数字,远远超过艾滋病和禽流感的死亡人数。所以乙肝的防治同样迫在眉睫,刻不容缓。由于乙肝的发病机制至今尚未彻底明了,多数学者认为与机体免疫功能低下,感染HBV后出现免疫应答或免疫调节功能紊乱,导致肝脏损伤有关。因此,国内外尚无很满意的治疗方法及特效药物。为了阻止乙肝严峻形势的进一步加剧,减轻患者的病痛,减少社会的压力,迫切需要进一步研发更有效的乙肝治疗药物。笔者对用于临床的乙肝治疗药物及其研究概略以及新药研发思路进行综述,以便为相关研究人员提供参考。

1　药物的应用　

目前对慢性乙型肝炎采用抗病毒、免疫调节、改善肝功能和和抗肝纤维化等治疗,抗病毒治疗是其中最主要的治疗措施。

1. 1　抗病毒药　

1. 1. 1　干扰素( interferon, IFN) 　因其具有干扰病毒感染和复制的能力故称干扰素。抗病毒机制是IFN与细胞膜特异性受体结合,在细胞内产生抗病毒蛋白,通过激活核苷酸内切酶,使病毒单链RNA和mRNA降解,抑制病毒合成。其作用位点是HBV2DNA。此外, IFN又能增强免疫功能,如NK细胞活性,增加HLA抗原表达,而HLA是NK细胞和TC细胞的靶抗原,因而可使免疫力增强。其中IFN2α可以促进肝细胞表面HBeAg的表达,活化T淋巴细胞介导的免疫反应,增强NK细胞裂解病毒感染细胞的功能,刺激被病毒感染的细胞表达MHCⅠ类分子,增强CTL 的活性,为乙肝标准化治疗方案首选用药之一。

IFN制剂有自然的和重组的两类。临床应用的IFN主要是从大肠埃希菌中获得的基因重组蛋白,仅表现单一亚型,如α21b。

主要用于病程在半年以上,有活动性病毒复制(血清HBeAg/HBV2DNA阳性) 和活动性肝病[血清丙氨酸氨基转移酶( alaninea minotransferase,ALT)升高, >正常值上限2倍, < 250U·L - 1 ;肝活检示慢性活动性肝炎]证据的患者。IFN为目前抗肝炎病毒有效药物,但IFN2α的抗HBV作用主要是抑制病毒复制,难以清除病毒, 且复发率较高, HBV 的完全应答率为30%～40% ,而且对一部分患者,长期低剂量使用IFN会出现视神经不可逆损伤等不良反应。为提高应答率和防止耐药毒株的出现,临床中除了用IFN2α进行标准化治疗外, IFN2α与核苷类类似物拉米夫定( lamivudine, LMD ) 或泛昔洛韦( famcilclovir, FCV) 、IFN2α与胸腺素( thymosin2α1, Ta1) 、IFN2α与粒细胞2巨噬细胞集落刺激因子( granulocyte 2macrophagecolony2stimulating factor, GMCSF)等联合治疗,为单用IFN无应答提供了有效的治疗措施。后来将IFN进行结构修饰,通过聚乙二醇技术,将一个相对分子量约40 000的聚乙二醇( PEG)支链结合到基础的IFNα22a分子上,使药物的半衰期由7～10 h延长到77 h,只需每周1次给药,也能保证在给药间歇期间保持有效的血药浓度[ 2 ] 。临床实验表明,聚乙二醇IFNα22a 6 个月较传统的IFNα22a抗病毒治疗疗效提高了近1倍。4个月疗程的聚乙二醇IFNα22a 治疗HBeAg ( + )的慢性乙型肝炎取得33%的HBeAg和HBV2DNA的转阴,而对照组仅有12%[ 3 ] 。意大利BON INO 等[ 4 ] 通过一项临床试验表明, 单用聚乙二醇IFNα22a或联合拉米夫定治疗HBeAg阴性的慢性乙肝,停止治疗后24周的生化和病毒应答率显著高于单用拉米夫定。

1. 1. 2　核苷类抗HBV 药物　核苷类抗HBV的原理主要是在体内以三磷酸化形式与天然核苷酸发生竞争性结合至延长中的DNA链,导致链合成的终止,和与HBV2DNA聚合酶结合,通过限制该酶的移动而影响其活性。核苷类药物至今为止,仍是主要用于临床的一线药物,其类似结构有效物的研究仍然是药物研发单位的开发重心。

目前主要用于抗HBV 的核苷类药物有能迅速抑制病毒DNA的逆转录过程,在短时间内将体内血清HBV2DNA降低到不能被检出水平的特点,但是对蛋白的合成影响较慢,易于诱导DNA聚合酶的突变形成耐药性,长期使用也出现的耐药性是目前临床治疗中出现的主要障碍,和其强抑制HBV复制作用一样引起人们的极大关注。拉米夫定是第一个被批准用于治疗慢性乙型肝炎的核苷类似物药物。现在仍然是首选的抗HBV的药物之一[5 ] 。

耐药突变常发生在拉米夫定耐药株的P基因的RT(逆转录酶) B区和C区。其中以C区YMDD变异最为常见。一旦发生了YMDD变异,拉米夫定对HBV2DNA的抑制作用就大大下降,称为拉米夫定抵抗。B区rtL180M (L528M)突变、rtV173L突变[6 ]、rtA181T突变[7 ]  ,其中M204V突变株的复制能力比M204 I强[8 ] 。YMDD基序的突变在HBV感染者中,即使没有使用过拉米夫定的治疗也有报道。但是其机制还不清楚[9 ] 。C区只有rtM204V / I时,突变复制能力株显著低于野生株,当同时出现B区L180M突变时,复制能力恢复。只有阿德福韦和恩替卡韦对抗这5种HBV突变株有效,其中这两者的用量与单个突变的相比更大剂量的才能阻止两处同时突变的变异病毒株。B 区L180M突变不仅恢复了C区突变株的复制能力,而且也导致了核苷类似物耐药性的产生[10 ] 。阿德福韦酯是阿德福韦的二吡呋酯,具有抗HBV活性[ 11, 12 ] 。阿德福韦酯能有效地抑制拉米夫定耐药变异株,但长期使用也存在耐药现象。主要是rtN236T和rtA181V[ 13 ] 。ETV是一种有效的选择性鸟嘌呤核苷,有显著的抗HBV作用[14 ] 。对LAM耐药株有效[15 ] ,在长期治疗中少见的ETV耐药性也有出现,已发现有rtT184G、rtI169T和rtS202 I突变。拉米夫定耐药合并的逆转录酶出现rtT184G和rtS202 I突变,导致ETV敏感性降低和治疗失败[16 ] 。

1. 1. 3　植物天然药物　一些清热解毒、活血化瘀的中草药对乙肝的治疗也有较好的疗效。如草果、黄连、叶下珠、北山楂、虎杖、猪苓和大黄等具有抗HBV活性,其中目前用于治疗乙肝的有苦参素、齐墩果酸片、茯苓多糖、猪苓多糖等。

1. 2　免疫调节药　目前,抗HBV药物如IFN和核苷类似物,只能抑制HBV复制,而不能在人体内彻底清除HBV,而且, HBV感染后,诱导IFN的能力下降,且使靶细胞的HLA21类抗原的表达低下,因此,停药后复发率较高[ 17 ] 。免疫调节药可以激活细胞毒T淋巴细胞(CTL) 、自然杀伤细胞(NK) 、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK) ,激活抗原特异的B 细胞、诱导内源性IFN产生等,从而提高机体细胞免疫功能,改善宿主的抗病毒状态,以达到抑制HBV复制的目的[ 18 ] ,促进乙肝病毒抗原指标转阴。

免疫调节剂有非特异性和特异性免疫调节剂两种,用于治疗慢性乙肝的非特异性免疫调节剂有胸腺素以及一些多糖等。特异性免疫调节剂,能提高对HBV特异性免疫功能,可以特异性识别、清除HBV。但特异性免疫调节剂,目前尚无药物用于临床,一些可望有治疗性疫苗,如HBsAg多肽疫苗、HBV2DNA核酸疫苗等还在研究中,免疫原性还有待改进。

1. 3　肝功能恢复和调节药　HBV虽无直接致肝细胞病变的作用,但可诱发人体的免疫应答,使肝细胞发生免疫病理,引起炎症、坏死和纤维化病变。因此,在抗病毒和免疫调节治疗的同时也离不开改善肝功能和和抗肝纤维化治疗。目前护肝药有双环醇、联苯双酯、齐墩果酸片、甘草酸制剂等。

2　研究开发策略　

目前临床治疗乙肝还存在许多障碍,如IFN的HBV应答率不高、核苷类药物的耐药性等,难以清除病毒,且复发率较高,尚还不能彻底治愈,一旦用药得终身服用。这些问题的解决,都赖于有效的抗HBV研发,下面将对抗HBV的药物研发的切入点进行总结,也是对抗HBV药物的研发的一个思考。抗病毒药物分别作用于病毒复制的不同时期和靶位,产生抑制病毒复制的作用。现有药物主要还针对HBV复制过程。

对于有效抗HBV药物的研发,总体上仍然着眼于作用于抑制病毒的黏附、穿入、脱壳、生物合成、组装和释放等环节,而目前没有作用于穿入和和脱壳过程的抗HBV的药物。这是药物研发的切入点之一[ 19 ] 。

核苷类似物能有效的抑制HBV的复制,能明显降低血清HBV2DNA的载量,这是临床运用的共识,但核苷类似物在抗HBV治疗中有着共同的特点,就是容易诱导HBV突变,突变的结果将导致停药后容易复发和耐药,总称耐药的产生。比如上面所提及的YMDD变异,变异株的复制能力低于野生株。

因此,一般YMDD变异株感染,血清中HBV2DNA水平较低,一旦停止拉米夫定治疗后,野生株可迅速重新复制替代变异株,导致停药后的复发。当发生YMDD变异而且成为优势株时,可引起对拉米夫定的耐药。其赖药性的产生,主要由于HBV基因组的多态性。药物诱导病毒产生变异,使药物的活性降低,这是耐药性产生的主要原因,其机制至今还未明了。可采取以下方式来应对耐药性给临床治疗的困难[ 20～22 ] :其一,寻找新的靶点,包括寻找作用于病毒复制以外环节的新药、寻找选择性针对各变种毒株当然更好是有多变种毒株共同的有效区域作为作用靶点的新药;其二,对耐药机制的深入研究、寻找新药或可替代药,合理选择用药(如ADV 、ETV对3TC耐药突变株有效)或联合用药治疗。这是抗HBV的药物研发的切入点之二。抗HBV药物在HBV复制和表达过程中有不同的作用位点。

IFN主要作用位点是HBV2DNA,它不仅可抑制病毒复制,还可以抑制病毒蛋白的表达。因此治疗有效的乙型肝炎患者血清HBV2DNA和HBeAg均可阴性。而核苷类似物的作用位点是抑制HBV2DNA多聚酶活性,使HBV2DNA复制受到抑制,不影响病毒蛋白的表达。但两者均不能有效地抑制HBVcccDNA (共价闭合环DNA) ,而且HBV2DNA 在复制过程中,以cccDNA作为复制的原始模板,一旦停药后, cccDNA可以作为HBV复制模板,重新转录复制,成为复发的重要原因。而目前的抗病毒药物尚不能彻底清除cccDNA。所以一旦停止抗病毒治疗,一段时间后就有较高的复发率[ 23, 24 ] 。所以研究以cccDNA为靶点的新药,这也是抗乙肝药物研发的切入点之三。体外实验和体内实验存在偏差,以及现有药物的选择性不是很高,因此存在一系列代谢稳定性和细胞毒性的问题。有效药物的结构修饰,前效化如喷昔洛韦侧链羟基成为双乙酸酯的前药泛昔洛韦有效提高了口服生物利用度;阿德福韦酯在细胞内转化为活性中间体阿德福韦,从而能避免给药后跨膜转运过程中的损失,表现为较高的药理活性。靶向制剂由于HBV属嗜肝病毒科病毒,主要利用肝细胞,在肝细胞内进行复制,感染邻近细胞,导致肝损伤。以及最新研发的ANA380 (LB80380)是ANA317 (LB80317)的口服前药,是一种选择性的HBV多聚酶抑制药。而且, HBcAg仅存在于感染的细胞核内,一般不存在于血循环中。所以理想的抗HBV药物应具有肝靶向性,选择性在肝组织,甚至肝细胞水平发挥药理活性。这样才能保证小剂量用药,就能在靶组织或细胞内有较高的局部浓度,有利于减少对正常组织的细胞毒性,减轻肾脏等体内的代谢负担,并有更好的治疗期望值。就目前的研究而言,主要有肝细胞半乳糖受体( hepatocyte galactose recep tor, H2Gal2R)以及抗体等介导的利用受体或免疫机能设计的肝靶向药物;利用脂质体或微球介导的利用机体不同的组织部位的生理学特性对不同大小微粒的不同阻留性而建立的靶向药物传递系统( TDDSS ) [ 25～28 ] 。

有效药物的结构修饰和靶向制剂的研发。这是抗HBV的药物研发的切入点之四。SEIGNERES等发现(DAPD,amdoxovir) 、[ ( - ) FTC ]、3TC、(L2FMAU)等抑制HBV复制的核苷类药物在作用机制上有明显的差异。体外实验发现,二氧戊环的核苷类似物DAPD主要抑制病毒负链的启动和延伸; FTC与3TC相似主要抑制病毒负链的延伸;然而,L2FMAU主要抑制DNA病毒的正链DNA的合成[ 29 ] 。以及对现有药物的分子作用机制的研究,也有利于与发现药物作用靶点和对药物构效关系规律的总体把握。这是抗HBV的药物研发的切入点之五。除IFN2α外的其他细胞因子制剂是近年来研制的新型免疫制剂。粒细胞集落刺激因子(G2CSF) 、巨噬细胞集落刺激因子(M2CSF) 、粒细胞2巨噬细胞集落刺激因子(GM2CSF)和IL212等也可望成为乙肝治疗的有效手段。这是抗HBV的药物研发的切入点之六。

化学和免疫治疗方法对抗HBV 感染的疗效还不是很理想,随着细胞生物学和生物化学的发展,基因治疗方法给抗病毒治疗带来全新的思路,生物大分子药物也被国际社会推向21世纪药物研究开发的前沿。人们对几种有望成为针对慢性乙型肝炎基因疗法的生物大分子药物进行了深入的研究,包括RNA干扰、反义寡核苷酸、核酶、干扰肽或蛋白质及治疗性DNA疫苗。生物大分子药物的开发,这是抗HBV的药物研发的切入点之七[ 30～32 ] 。病毒的DNA可整合于靶细胞的染色体中、肝以外的其他区域也有HBV的存在、慢性乙型肝炎易形成人体免疫耐受、对抗病毒药物治疗效果不佳、如何打破免疫耐受等也都属于新药研发所不能忽视的方面。

3　展望　

随着对病毒分子生物学、病毒基因组序列和病毒宿主细胞相互作用等学科发展,人们通过对乙型肝炎和抗乙型肝炎药物研究的深入,有效药物的进一步开发、优化,并用于临床,笔者有理由相信,对乙肝这一严重威胁人类身体健康的疾病的治疗,会有很好的前景。

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