骨肉瘤是一种临床常见恶性骨肿瘤，约占所有骨肿瘤的20%。其恶性程度高，好发于青少年，易复发和转移，预后较差。随着分子生物学理论和技术水平的提高，尤其是肿瘤分子生物学的发展，人们对骨肉瘤的发生机制在分子水平有了一定的认识。目前，针对骨肉瘤及其肺转移已研究开展了免疫基因治疗、反义基因治疗、抑癌基因治疗、自杀基因治疗及其联合基因治疗或联合其他方法的治疗等诸多肿瘤基因治疗方法，现综述如下:
1基因治疗方法
1.1免疫基因治疗
随着分子免疫学的发展及对肿瘤免疫认识的深人，人们认识到肿瘤细胞的免疫原性低，不能给机体免疫系统提供足够的免疫信号。如果把免疫原性相关分子导人肿瘤细胞并使其表达，增强瘤细胞的免疫原性，就可对机体免疫系统产生较强的免疫刺激，激活体内CTL细胞产生特异性抗肿瘤作用，以达到肿瘤基因治疗的目的。对骨肉瘤及其肺转移的基因治疗，研究较多的有细胞因子和B7分子系列。导人细胞因子基因的方法杀伤肿瘤细胞是基因治疗的重要策略之一。Worth等使用含有鼠IL-12基因的腺病毒载体通过鼻饲的方法治疗骨肉瘤的肺转移，实验结果发现IL-12在局部得以表达，肺转移率下降。Lafleur等通过腺病毒载体转染IL-12基因骨肉瘤细胞，发现IL-12能够上调Fas的表达，诱导细胞凋亡，对骨肉瘤的肺转移有抑制作用。Walling等用反转录病毒做载体，将单纯疤疹病毒胸腺啼陡酶基因(herpessimplexvirusthymidinekinase，HSV一TK)和IL一2基因导人人骨肉瘤细胞，结果发现细胞死亡并有很强的旁观者效应(bystandereffect)，即在死亡细胞的周围有大量的未被转染细胞死亡。DeWilt等利用腺病毒介导IL一3R局部肢体灌注的方法治疗小鼠的肢体骨肉瘤，发现有抑瘤作用并且比局部注射和系统给药的方法有效。此外，尚有许多其他细胞因子基因的研究，如IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-13,IL-18,TNF,IFN及GM-CSF基因等，以上基因均能通过所分泌的细胞因子，激活体内CTL细胞产生特异性抗肿瘤作用。B7分子在T细胞活化中执行第2信号的功能，如骨肉瘤细胞如不表达该分子或仅弱表达，则无法被机体免疫系统识别监视而无限生长。将B7分子导人骨肉瘤细胞可以增强或诱发机体抗肿瘤免疫性并增强免疫细胞对骨肉瘤细胞的识别和杀伤能力，是骨肉瘤基因治疗的另一重要策略。Nagamori等研究发现B7-1,B7-la和B7-2均对荷瘤鼠有明显的抗肿瘤免疫效应。
1.2反义基因治疗
反义基因治疗针对性地选择骨肉瘤细胞中发挥重要作用的癌基因、抑癌基因、生长分子和(或)其受体基因，通过反义核酸技术进行特异性的封闭，诱导肿瘤细胞发生凋亡或死亡，使肿瘤细胞消退或彻底消失，已达到治疗骨肉瘤的目的。反义核酸是通过碱基配对，在基因复制、转录、转录后加工及翻译等几个水平调控基因的表达，用于基因治疗的反义核酸有反义DNA、反义RNA及核酶。骨肉瘤中有许多癌基因(如mdm2,。一myc等)及抑癌基因(如户3,RB等)的异常表达，这为骨肉瘤反义基因治疗提供了靶向基因选择的理论基础。
p53是一种重要的抑癌基因，它的突变或通过与细胞蛋白的结合所致的p53失活在恶性肿瘤中发生率很高。应用反义技术针对突变p53基因或其mRNA设计出反义核酸片断，封闭突变p53基因，抑制其表达，进而导人wt卢3，这对有获得性功能的p53突变骨肉瘤的基因治疗有重要意义，直接抑制骨肉瘤中突变p53基因的研究尚不多。Tsang等[’]将MRP1和p53AS一ODN转染人p53高突变的SAOS细胞中，发现细胞呈现对阿霉素的敏感性，而且加人p53AS一ODN后明显抑制MRP1的表达并逆转了细胞对阿霉素的耐药性。骨肉瘤中常有mdm2的过表达，通过反义技术抑制或封闭mdm2基因的表达，解除对p53诱导凋亡功能的抑制，能有效提高抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞凋亡的效应。c一myc基因是发现较早的原癌基因之一，它的过表达与骨肉瘤细胞的生长、增殖、转移及病人预后有密切关系。应用反义核酸技术将c一mycAS一ODN转染人骨肉瘤细胞中能够抑制c一myc基因的表达，影响细胞增殖周期，诱导肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长，已达到基因治疗的目的。Xie等构建表达反义。-myc的重组腺病毒(Ad一As-c一myc)，并在体外转染骨肉瘤MG-63,U20s细胞，发现Ad一As-c一myc能够产生GZ/M期或G，期阻滞，诱导骨肉瘤细胞凋亡，并抑制骨肉瘤细胞的增殖。Maggard等则分别利用TGF一R1和TGF一p2反义基因免疫荷瘤鼠，观察到小鼠瘤结节退化。
1.3抑癌基因治疗
正常细胞由于抑癌基因突变缺失而易于发生突变，转化为肿瘤细胞。针对抑癌基因的基因治疗策略就是恢复因突变缺失而丧失的抑癌基因的正常功能。p53基因是目前研究较为深人的抑癌基因之一。除了以上所述反义基因的方法，Tsuchiya等将野生型P53蛋白导人骨肉瘤细胞，发现可以抑制肿瘤细胞生长，并与化疗有协同作用。Densmore等利用PEI-p53复合体气溶胶的方法治疗人骨肉瘤小鼠转移模型，发现可以有效地减少肺转移灶数目和大小，同时减少全身毒性。而Bougeret等设计的p53衍生物CTS1在mdm2过表达，在骨肉瘤生长抑制方面较wtp53更为优越。
凋亡相关基因bcl一2,p15,p16及Rb基因军与骨肉瘤的生长增殖相关，它们的缺失在骨肉瘤中广泛存在，因此，在基因研究中亦被广泛应用。
1.4自杀基因治疗
肿瘤自杀基因疗法又称为病毒导向酶解药物前体疗法。其原理是将前药转换酶基因，即自杀基因构建表达在载体上，导人肿瘤细胞，自杀基因则可将无毒药物前体代谢成有毒药物，通过干扰细胞分裂时DNA合成，最终导致细胞死亡，已达到基因治疗的目的。此外，某些自杀基因介导的肿瘤基因治疗还具有“旁观者效应”，增强了细胞毒效应。目前已有诸多针对骨肉瘤的自杀基因研究，如HSV-Tk(单纯疤疹病毒一胸腺嚓陡激酶)、CD/5Fc(胞嗜陡脱氨酶)及Dm-dNK(黑腹果蝇DNA激酶)等。其中研究最多的是HSV一1一Tk/GCV(单纯疤疹病毒-1型一胸腺啼咤激酶/无环鸟苷)。Set。等将HSV-1-Tk基因在体外转染人不同的骨肉瘤细胞株，发现骨肉瘤细胞对GCV异常敏感，很容易被杀死。在体内实验中也观察到明显的肿瘤生长及肺转移的抑制作用。
1.5联合基因研究
联合基因研究及基因联合其他疗法治疗骨肉瘤的疗效可能更好，联合应用可能产生协同效应，增加疗效，并可能较轻单用一种药的毒副作用，这将成为基因治疗的重要发展方向之一。目前研究最多的是自杀基因与细胞因子的基因联合治疗。Walling等用反转录病毒载体将HSV一Tk基因和人IL-2基因联合转染人人骨肉瘤细胞，在体外观察到显著的旁观者效应。Tsuji等则用腺病毒介导B7一1/Fas基因转染鼠骨肉瘤细胞，发现能同时激活T细胞的免疫效应，并能诱导肿瘤细胞的凋亡，在抑制骨肉瘤肺转移和提高生存率方面较单一的B7一1基因更为有效。已有将B7基因分别和GM-CSF,IL-2,IL一7,IL-12,IL-18等基因联合应用的报道，均诱发了较强的抗肿瘤作用和免疫应答作用，并强于单独基因免疫效应。CD/5Fc(胞嘧啶脱氨酶)及Dm-dNK(黑腹果蝇DNA激酶)等自杀基因在骨肉瘤的联合治疗中也得以应用.
基因联合化疗的治疗方法也是一个很有前景的研究方向。基因转染可能提高化疗的疗效，减少对化疗药物的耐药性，同时化疗药物亦可能增强肿瘤对基因的敏感性，二者产生协同作用。Tsang等将MRP1和p53AS一ODN转染人p53高突变的SAGS细胞中，并联合应用阿霉素，加人户3AS-ODN后明显抑制MRP1的表达并逆转了细胞对阿霉素的耐药性。肖华斌等将Rb反义寡核昔酸(AS一ODN)转染人成骨肉瘤(MG一63)细胞，并联合应用阿霉素，发现二者联合应用后疗效显著增强。Me等以腺病毒为载体，构建表达反义cmyc的重组腺病毒(Ad一Asc一myc)，并在体外转染骨肉瘤MG一63细胞，并联合应用顺铂，实验证明:Ad一Asc一myc能够增加顺铂对MG一63细胞的促凋亡作用。
融合基因治疗使骨肉瘤联合治疗的一种新方法。Ramnaraine等构建融合基因NGFR一CD转染鼠骨肉瘤细胞，发现前药5一Fc在体内外均可通过直接杀伤或旁观者效应杀死瘤细胞，起到基因治疗的目的。
2基因载体及特异性靶向性基因表达
近年来基因治疗的实验研究虽然在靶基因、载体和治疗途径的选择上作了大量的研究，但体内实验的效果远不如体外实验，这很大程度上取决于基因的传导和表达。体内基因治疗的一个主要局限性是缺少一种将目的基因运输到体内肿瘤细胞的有效方法。目前，病毒、质粒、脂质体和聚乙胺(PEI)等均通过研究证实为合适的载体。Song等以杆状病毒载体介导wtp53转染骨肉瘤细胞，发现杆状病毒载体的传导率接近100%oMaruyama一Tabata等用EB病毒部分基因组成的质粒与合成的非病毒载体PAAD结合成杂交载体(EBV/polyplex),在体内能有效将HSV一Tk基因转移人骨肉瘤内。Me等则是使用腺病毒为载体将反义c一myc片断转染人人骨肉瘤细胞中，取得了满意效果。Corsi等「211发现壳聚糖DNA微粒无细胞毒性，用于非病毒基因转移，是一种新的基因转移治疗工具。而肖华斌等〔16〕在将Rb反义寡核昔酸(AS一ODN)转染人成骨肉瘤(MG一63)细胞的研究中，发现使用脂质体后反义寡核昔酸的转染率明显增高，提示脂质体亦是一种有效的载体工具。Jia等利用PEI介导IL一12基因并通过鼻饲的方法治疗骨肉瘤的肺转移，实验表明PEI是骨肉瘤肺转移基因治疗中传递基因的良好工具。以上载体对肿瘤细胞几乎无特异性，因此寻找体内传导率高、肿瘤特异性高的转基因方法已成为学者们探索的热点。近年来，一些学者采用肿瘤特异性启动子联合自杀基因来治疗骨肉瘤。骨钙蛋白(osteocalcinoc)是一种非胶原蛋白，它在成骨细胞中高表达，在成骨性骨肿瘤中具有特异性。Shirakawa等重组腺病毒一骨钙蛋白启动子一胸腺嚓陡激酶(Ad一OC-Tk)，在体内外转染人成骨肉瘤细胞，均表现高选择性阻断肿瘤细胞生长，提示骨钙蛋白是一种有效的特异性基因转载工具。Majumdar等[241采用hTERTp和CMVp/Tk基因分别转染人OS143B细胞，使用GCV获得相近的肿瘤消退率和生存率，并且hTERT启动子表现出较强的肿瘤特异性，在健康组织和器官中未见自杀基因的表达，消除了自杀基因对正常组织的毒副作用。
3.存在的问题及展望
尽管骨肉瘤的基因研究已经取得了一定的进但目前的工作绝大多数尚处于实验阶段，是探索性的，特别是对于体内试验的研究。很多基因治疗缺乏特异性靶向，体外实验和动物实验效果优于体内试验。如何构建安全高效转移并高表达的载体系统，如何开发更多的对恶性骨肿瘤治疗确实有效的基因，如何更好地实现基因调控，如何实现基因联合治疗和其他疗法联合应用等面临着许多问题，还有待广大学者研究解决。骨肉瘤的基因治疗是一个非常有前景的研究热点，随着分子生物学技术的发展及人类基因计划的完成，相信这一技术将会成为临床骨肉瘤有效的治疗方法，最终为人类造福。