现代肿瘤医学 2006年10月第14卷第10期

姚德茂，陈武科，潘承恩

【基金项目】陕西省科技攻关基金资助[编号：2001K10一G5(2)]；

陕西省自然科学基金资助(编号：2002C251)

【作者单位】西安交通大学医学院第一附属医院外科，陕西西安

【作者简介】姚德茂(1962一)，男，陕西省蒲城人，副教授，副主任医师，博士，主要从事消化道肿瘤外科治疗和生物治疗的研究。

【中图分类号】R735．35 【文献标识码】A 【文章编号】1672—4992一(2006)10—124—04

【摘要】 目的：探讨自体肿瘤疫苗的作用机制及I临床意义。方法：50例进展期结肠癌病人术后，以自体肿瘤细胞疫苗辅助主动免疫治疗。术后第4周开始免疫接种(共4次，每次间隔7～1O天)；接种前3天及第4次接种后1周，采集外周血。采集血清监测血清IFN-γ、IL一10水平；用PPD及自体肿瘤抗原做皮肤迟发型过敏试验(DTH)，48小时后测量红斑、硬结大小(mm)；对DTH反应部位皮肤活检，用免疫组化染色，了解局部免疫活性细胞浸润；临床随访。结果：自体肿瘤细胞疫苗治疗后：血清IFN-γ水平升高，由(6．01±2．30)Pg／ml升至(12．98±4．65)pg／ml；而IL一10水平由(19．80±10．15)pg／ml降至(8．92±4．60)pg／ml，差异有非常显著性(P<0．05)；治疗前后病人对自体肿瘤抗原的特异性DTH反应明显增强(P<0．01)；DTH反应部位，CD8+T细胞、CD4+T细胞及DC细胞浸润明显增多；病人耐受性良好，无溃疡等严重副作用发生；随访结果显示：术后辅助自体肿瘤疫苗主动特异性免疫治疗，可延长结肠癌病人的无瘤生存时间，降低复发率及死亡率。结论：自体肿瘤疫苗可激发病人特异性细胞介导的免疫反应；可改善肿瘤病人的抗瘤免疫反应；自体肿瘤疫苗主动特异性免疫治疗，对于杀灭残留癌细胞、抗转移及复发有重要作用。

【关键词】人结肠癌；细胞免疫；自体肿瘤疫苗；特异性反应；主动特异性免疫治疗；

进展期肿瘤病人的预后与机体细胞免疫状态有密切关系。手术切除癌块对于减轻瘤负荷及对机体免疫功能的恢复有重要作用，对提高免疫治疗效果有重要作用。自体肿瘤疫苗主动特异性免疫治疗作为预防术后肿瘤复发、转移的新的治疗手段已引起人们重视，且取得较好的疗效。我们对50例进展期结肠癌病人术后用自体肿瘤细胞疫苗对其进行主动特异性免疫治疗(Active specific Immunotherapy，ASI)，观察其细胞免疫功能变化，探讨其抗瘤作用机制及临床意义，现报道如下。

1 材料和方法

1．1 材料

1998年7月～2005年4月3例曾在西安交大第一医院的进展期结肠癌病人被列入此研究。男30例，女20例，年龄36岁～66岁。其中stage II：24例；stage Ⅲ ：26例(见表1)。列入此研究的病人满足以下条件：病理诊断为进展期结肠癌；术后，病人愿意接受ASI，而不愿意接受放疗、化疗或其他免疫治疗；术后，因病情需要，曾行放疗或(和)化疗，但在ASI前，放疗或化疗已经停止3～6月以上；术后，曾行放疗或(和)化疗，但不敏感或因毒副作用中断治疗，愿意接受ASI之前，停用放疗或(和)化疗3～6月以上者；一般情况Kamofsky评分≥6o分，并预计生存时间≥3月的病人；肝肾功能正常；骨髓功能正常。

1．2 方法

1．2．1 自体肿瘤细胞疫苗的制备分离肿瘤细胞：将手术切除的新鲜肿瘤标本立刻放入含0.05mg／mL庆大霉素的HBss中，无菌快速送至实验室，超净台内以含抗菌素的HBSS洗涤3次，去除坏死组织、脂肪组织和周围的正常组织，以手术刀片切碎至<1mm³后，置入含有胶原酶、透明质酸酶和DNA酶的混合液中，37⁰C下消化2h～4h；不连续梯度离心2000r／min×20min收集肿瘤细胞，以HBSS洗涤3次，台盼兰排斥实验计数活细胞达80％以上，调细胞浓度至2×10⁷／ml，-70⁰C低温冰箱冷冻，液氮冻存备用。疫苗制备：取冻存的瘤细胞，37⁰C快速复苏，以含10％(体积分数)人AB血清的RPMI1640培养基洗两次，悬浮于0．5ml生理盐水中，反复冻溶5次，并用细胞匀浆器研磨以灭活瘤细胞。加重组人白细胞介素2(rIL一2)10万单位、重组人粒细胞单核细胞集落刺激因子(rGM—CSF)0.05mg、特制中药提取物及福氏不完全佐剂，总体积1ml，制成油包水乳剂疫苗及水剂疫苗，水剂疫苗除不含福氏不完全佐剂外，其余同上。

1．2．2 免疫程序：手术后第4周开始ASI治疗，术后因病情需要放疗或化疗者，在放、化疗停用3～6月后，再进行ASI治疗。ASI治疗分4次接种，每次间隔7～10天；每次接种4个部位，以临近淋巴结为佳(即双大腿内侧近腹股沟淋巴结处，上肢近腋窝淋巴结处)。第1、2次为含福氏不完全佐剂的疫苗；第3、4为不含福氏不完全佐剂的疫苗。第1、2次免疫后，每天肌肉注射rIL一2 10万单位和GM—CSF 50 g，连续3天。

1．2．3 免疫效果评估：① 体外检测 主动免疫治疗前3天，第4次免疫治疗后一周，采集病人血清，检测血清中以流式细胞分离术／细胞内细胞因子检测分析治疗前后外周血淋巴细胞中IL一10、IFN-γ水平。血清IL一10、IFN-γ水平测定，人IFN-γ ELISA试剂盒及人IL～10 ELOISA试剂盒由美国Genezyme公司提供。结果判断：每个标准品业和血清标本的OD值去零孔的OD值为绝对值；绘制标准曲线，求解曲线方程，根据OD值计算标本的IL一10、IFN-γ。② 在体检测在主动特异性免疫治疗前3天及第4次免疫治疗后1周，以PPD(5TU／0．1m1)、自体肿瘤细胞抗原(1．0×10 ／0．1ml)，在同一时间，在患者上肢前臂皮内注射，观察48小时后，评估对自体肿瘤细胞抗原的特异性DTH反应，以PPD作为非特异性对照，测量注射后红斑、硬结大小(inln)。③DTH反应局部皮肤活检在主动特异性免疫治疗前及4次治疗后，切取DTH反应局部2mm×6mm皮肤组织，制作病理组织学切片，进行免疫组织化学染色(Envision二步法)，镜下观察计数CD4+、CD8+、DC细胞等在DTH反应局部的浸润情况。评判标准：在40×10高倍视野下，选择5个视野，分别计数CD4+、CD8+、DC等细胞数，取其平均值。

1．2．4 统计学处理：术后辅助ASI治疗，免疫参数在治疗前、后结果以 4-s表示，采用治疗前后配对t检验，所有资料均用计算机软件进行统计处理。

1．2．5 临床随访：ASI治疗的病人及对照组病人，每3～6个月拍胸部X线片或胸、腹部CT扫描，查血清CEA、CA199，了解肿瘤有无转移或复发(见表1)。

表l 结肠癌病人的临床特征

2 结果

2．1 血清IL一1O／IFN-γ浓度变化：ASI治疗前后，对50例进展期结肠癌病人血清中IL一10及IFN-γ进行测定，发现：IFN-γ浓度明显升高(P<0．05)，IL一10浓度下降(P<0．05)，见表2。

2．2 PPD及自体肿瘤抗原反映的评估：50例进展期结肠癌病人自体肿瘤疫苗治疗后，病人对

PPD的反应无明显增强，结果直径由(6．9 4-2．8)mm增大到(10．7 4-4．9)mm，P>0．05；病人对自体肿瘤抗原的迟发型过敏反应(Delayed—type herpersensitivity，DTH)则明显增强，硬结由(4．7 4-1．9)mm增大到(19．9 4-5．1)mm，P<0．01，提高机体对自体肿瘤抗原的特异性反应明显增加。

2．3 DTH反应局部皮肤活检：免疫组织化学染分析提示在DTH反应局部CD4 T细胞、CD8 T细胞及DC细胞等免疫活性细胞在ASI治疗后，在DTH反应局部浸润明显增多(表4)。表4 ASI治疗后：CD8+T细胞、CD4+T细胞及DC细胞在DTH反应局部浸润数目的变化。

2．4 不良反应：红斑、肿胀及疼痛是最常见的局部表现，发生率95％ ；但无溃疡发生。红斑、肿胀及疼痛持续约3—9天，可自行消退；硬结持续时间较长，1—3月后缩小或消退。全身反应包括：短暂性发热(T<38⁰C)，发生率70％，未于特殊治疗好转；乏力(困)发生率100％ ，持续3—7天，自行减退；寒战、恶心及呕吐发生率极低，分别为6％ ，程度缓和．可不予特殊处理。无肝肾功能损害及全身自体免疫疾病发生(如关节炎、皮肤血管炎等)。

2．5 随访情况：ASI组随访16—78个月，有5例复发(10％)，4例死亡(8％)，平均无瘤生存时间60个月；对照组随访14—72个月，有9例复发(19．6％)，7例死亡(15．2％)，平均无瘤生存时间为51个月(见表1)。

3 讨论

动物实验及临床研究发现：肿瘤疫苗诱导的免疫反应分为2型(TYPE1和TYPE2)。绝大多数强免疫原性肿瘤引起I型细胞介导的免疫反应，T细胞分泌肿瘤特异性IFN-γ，肿瘤溶解坏死；而弱免疫原性或所谓的非免疫原性肿瘤则引起Ⅱ型免疫反应，无抗瘤效应，肿瘤继续生长。主动特异性主动免疫(自体疫苗)治疗的策略就是使弱免疫原性肿瘤通过佐剂等手段予以修饰，增强其免疫原性，使Ⅱ型免疫反应转化为I型反应，由免疫无效转化为抗瘤反应。此研究对50例进展期结肠癌病人术后辅助自体肿瘤细胞疫苗主动特异性免疫治疗，治疗前后，病人对肿瘤特异性抗原的DTH反应明显增强，而对非特异性抗原(PPD)反应无明显变化；DTH反应局部有较多的CD8+T细胞浸润，提示自体肿瘤疫苗可引起特异性细胞免疫反应(I型) 。穿孔素／颗粒酶分泌途经及FasL／Fas途径是特异性细胞毒性T细胞(CTL)杀伤肿瘤的主要机制，已被证明。近来用穿孔素／颗粒酶及FasL／Fas基因敲除小鼠的实验提示：特异性CTL杀伤肿瘤细胞亦可通过IFN-γ实现。此研究提示：治疗后血清中IFN-γ浓度明显升高，而IL一10浓度明显下降(P<0．05)；免疫组织化学染色分析提示：DTH反应局部有较多的CD4+T及DC细胞浸润。IFN-γ浓度升高，CD4+T细胞及DC在DTH反应不为浸润明显增多，对增强肿瘤细胞MHC I及MHCⅡ类抗原表达，对CD4+细胞提呈肿瘤抗原以及辅助CD4+完成有效的抗肿瘤反映有重要作用㈨。

临床研究及应用发现：自体肿瘤疫苗的抗癌机制可能为：① 可以明显改善病人的抗瘤免疫反应。表现在：血清IFN-γ上升，而IL一10水平下降；DTH反应局部有较多的CD4+T及DC细胞浸润。② 可激发机体特异性细胞免疫反应。表现在：机体对自身肿瘤抗原的特异性DTH反应明显增强；DTH反应局部有较多的CD8+T细胞浸润。BCG是目前应用最广的佐剂，可明显增强肿瘤细胞的免疫原性及提高疫苗疗效已被肯定，但含活BCG肿瘤疫苗应用后，皮肤溃疡是最常见最严重的不良反应。此研究在动物实验的基础上，对疫苗制剂进行了改进。在肿瘤细胞中，加入IL一2、GM—CSF，特制中药提取物及福氏不完全佐剂，制备成油包水乳剂自体肿瘤苗，观察发现：所有患者耐受性良好，生活质量高，无皮肤溃疡及严重不良反应发生。IL一2及GM—CSF是具有多种生物活性的细胞因子，近年来，在肿瘤免疫治疗中的作用倍受重视。局部小剂量应用IL一2及GM—CSF，对增强宿主对自体肿瘤细胞的特异性迟发型过敏反应(DTH)、活化抗原提呈细胞、增强CTL活性、引起强大的免疫反应有重要作用。此次研究过程中，在自体肿瘤细胞瘤苗制备中，加入小剂量IL一2及GM—CSF，并在第1、2次免疫后3天内，肌肉注射小剂量IL一2及GM—CSF，方法简单且无不良反应，取得了较满意的结果。临床对照分析提示：ASI组的结肠癌病人较对照组死亡率及复发率均明显降低，且无瘤生存时间延长(P<0．05)，可能与ASI治疗后，病人特异性细胞免疫功能增强及整体抗瘤免疫反应增强有一定关系。术后辅助自体肿瘤疫苗ASI治疗，可能在杀灭残留癌细胞、阻抑肿瘤复发、提高远期疗效有一定作用，可能成为术后重要的治疗方法。

参考文献(略)