抗肿瘤血管生成主动免疫治疗研究进展

国际免疫学杂志2007年1月第3O卷第l期

吕秋琼 潘建平

基金项目：浙江省科技攻关重点项目资助(2005C230005)

作者单位：310058 杭州，浙江大学免疫学研究所

          (现工作于绍兴市第六人民医院)

通讯作者：潘建平E—mail：jppan@zju．edu．cn

摘要 肿瘤血管生成在肿瘤生长、侵袭、转移中具有十分重要的作用。调控血管生成的因子很多，包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮细胞生长因子(EGF)等。近年来抗血管生成的肿瘤治疗已经取得较大进展，特别是抗肿瘤血管形成主动免疫治疗，已经成为抗肿瘤研究的热点。因而，以异种同源分子和非异种同源分子为疫苗的研究很有意义。

关键词 肿瘤；肿瘤血管生成；主动免疫治疗；异源同种

肿瘤血管生成是指在肿瘤生长过程中新血管的形成，包括从微血管前期到毛细血管形成新的血管结构。恶性肿瘤的生长与转移必须依靠新生血管提供足够的营养才能实现，近年来，以抑制或破坏肿瘤血管生成为目的的肿瘤治疗新方法已成为肿瘤学领域新的研究热点。抗肿瘤血管生成治疗策略的主要优点是：不易产生耐药性；药物最易达到作用部位，即血管的表面；对具有血管新生的肿瘤均有效；新生血管内皮细胞的有限损害可抑制或消减大量的肿瘤细胞等。

1 肿瘤血管新生对肿瘤生长及转移的作用

1．1 新生血管在肿瘤生长中的地位

肿瘤血管形成在肿瘤生长、侵袭和转移中具有重要意义，如果没有新生血管进入肿瘤为其带来足够的氧气和营养，并运走代谢产物，肿瘤直径将很少超过2～3mm，因为仅靠周围的血管对肿瘤弥散作用是完全不够的，肿瘤只能处于休眠状态或发生退化。如果血管一旦长入肿瘤组织，提供给肿瘤组织营养和氧气的方式由弥散转变成血流灌注，其代谢产物将能够被及时和彻底地清除，则肿瘤呈指数生长，显现出无限制扩张的趋势。肿瘤的生长和血管生成是相辅相成的。肿瘤细胞产生的促血管生成因子能够刺激内皮细胞的生长及生存，而血管的生成不仅是提供营养、氧气和运走代谢物，血管内皮细胞还可向肿瘤提供生长启动的因子。

1．2 肿瘤远处转移的必须条件

血管生成是肿瘤转移的必由之路，也是肿瘤转移的通道之一。通过新生血管将原发的肿瘤细胞运送到大循环中，从而转移至靶器官。一般认为，如果没有新生血管长入，肿瘤极少发生转移。一旦血管长入，就有可能出现转移，而且长入的微血管数量越多，原发肿瘤细胞进入血循环机会就越大。

2 肿瘤血管形成的特点与调控

肿瘤血管形成的全过程与正常生理过程的血管生成具有相似性，涉及到一系列形态学及生化学方面的改变。形态学改变包括内皮细胞降解母体小静脉的基底膜、内皮细胞的定向运动、有丝分裂、血管腔形成、芽式生长并形成血管袢、产生新的基底膜、外膜细胞形成等一系列步骤。通常情况下内皮细胞的更新需要数百天，在体内处于休眠状态，是体内的极度静止细胞。血管生成时，微血管内皮细胞的增殖速度同骨髓细胞相似，分裂率约6×10 细胞／h。生化学机制涉及到血管生成因子与血管生成抑制因子之间的调节关系，如上调血管生成因子或下调血管生成抑制因子，其能使内皮细胞增殖和血管形成，这种“血管性开关”是肿瘤生长所必须的。

主要的血管生成因子和相关因子有：血管内皮细胞生长因子(VEGF)、酸性及碱性成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGFa、TGF．B)、胎盘生长因子(P1GF)、血管生成素(angiogenesis)。主要的血管生成抑制因子有：TNF-Ot血管抑素(angiostatin)、内皮抑素(endostatin)、IFIV等，其中VEGF及其受体介导的信号转导是肿瘤血管生成中的限速步骤，对肿瘤的血管形成具有重要作用。

3 抗肿瘤血管生成的主动免疫治疗

以肿瘤抗原为基础的疫苗能主动特异地激发机体对肿瘤的免疫应答，然而一般情况下机体免疫系统对自身分子呈免疫耐受，难以诱导有效的免疫反应，以肿瘤血管为靶点的主动免疫治疗的主要任务就是打破自身免疫耐受。根据疫苗作用机制的不同可将抗肿瘤血管形成主动免疫治疗分为两类：一是以异种同源分子免疫交叉反应为基础的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗；二是非异种同源分子免疫交叉反应机制打破肿瘤血管生成相关分子免疫耐受的抗血管生成免疫治疗，即以VEGF、FGF、EGF等肿瘤血管生成调控因子为靶点的主动免疫治疗。

3．1 以异种同源分子免疫交叉反应为基础的抗肿瘤血管生成主动免疫治疗。

许多分子在生物进化过程中相对保守，它们既要保持序列的稳定性以维持相似的生理功能，又要有一定的进化以适应不同的环境和生理需要，这就形成了生物进化过程中不同种属之间的异种同源分子。在肿瘤治疗中可以用一定相似性的抗原来诱导机体产生针对自身分子的免疫反应。肿瘤组织中新生血管内皮细胞表面表达一些在正常血管内皮细胞上没有或几乎检测不到的蛋白分子，如ave3整合素及一些生长因子受体，小鼠血管内皮细胞上的这些蛋白质与人类及其他种属中相应的分子具有不同程度的同源性。Wei等 用经甲醛固定处理的异种(人、牛)血管内皮细胞作为疫苗免疫小鼠，利用其异种同源性成功打破小鼠体内对自身血管内皮细胞的免疫耐受，产生了保护性及治疗性的抗肿瘤免疫反应。实验中观察到，来自异种疫苗免疫小鼠的免疫球蛋白在体外能够抑制内皮细胞的增殖。过继性实验显示纯化的自身反应性免疫球蛋白能够抑制肿瘤血管生成，同时小鼠肿瘤生长受到抑制。免疫组化染色发现，异种疫苗免疫小鼠肿瘤组织中的血管内皮细胞上有自身抗体沉积。Western blot检测发现，小鼠内皮细胞提取物与异种疫苗免疫小鼠血清反应出现多个阳性条带，其中至少有两个条带的相对分子质量分别为220 000和130 000，与已知的血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)以及整合素hv的配体结合部位的相对分子质量相近。

研究发现，异种血管内皮细胞疫苗抗肿瘤作用的产生和诱导抗小鼠血管内皮细胞自身抗体的产生与体内CD4 T淋巴细胞有关。Wei等 利用异种分子的同源性针对性地选择了与肿瘤血管发生有关的几个重要靶分子进行研究。序列比较分析发现，非洲爪蟾的VEGF在氨基酸序列上与小鼠VEGF164及人VEGF165分别有75％和73％的同源性。他们构建了小鼠和非洲爪蟾VEGF的重组真核表达质粒，分别命名为MVEGF-P及XVEGF—P，并由此制备核酸疫苗。XVEGF-P免疫小鼠在多个肿瘤模型中产生了保护性及治疗性的抗肿瘤免疫效应，Western blot和ELISA检测都发现，在XVEGF．P免疫小鼠的血清中有抗VEGF特异性抗体存在，纯化的免疫球蛋白在体外能够抑制由VEGF介导的内皮细胞的增殖，体内过继性实验能够抑制肿瘤血管生成，产生抗肿瘤效应。经XVEGF—P免疫的荷瘤小鼠体内的VEGF水平低于对照组，抗CD4 单抗能阻断血清中免疫球蛋白IgG1和IgG2b的升高，同时也阻断了异种VEGF核酸疫苗的抑瘤作用。此后，学者们相继构建了非洲爪蟾VEGF重组蛋白质疫苗、非洲爪蟾FGFRI核酸疫苗、鸡整合素B核酸疫苗、鸡基质金属蛋白酶2(MMP2)核酸疫苗、鹌鹑VEGFR2重组蛋白质疫苗、鸡EGFR核酸疫苗以及蛋白质疫苗等。研究显示上述疫苗均能成功打破机体对自身分子的免疫耐受，产生针对靶向分子特异性的自身抗体，阻断其在肿瘤血管生成中相应的作用，抑制血管生成，产生依赖于CD4 T淋巴细胞的抗肿瘤效应。

3．2 以非异种同源分子免疫交叉反应机制为基础的抗血管生成主动免疫治疗

VEGF与表达在血管内皮细胞上的相应受体VEGFR2结合所引起的信号转导是血管生成中的限速步骤，在整个血管生成过程中发挥着关键的作用。因此，VEGFR2是抗肿瘤血管生成治疗的关键靶点之一，通过某种途径打破对VEGFR2的自身免疫耐受，诱导产生针对VEGFR2的免疫应答，破坏表达VEGFR2的血管内皮细胞是抗肿瘤血管生成治疗最经济、最有效的方法。Li等用VEGFR2蛋白冲击致敏的树突状细胞(DC)免疫小鼠能打破对VEGFR2自身免疫耐受，诱导针对VEGFR2抗体和细胞毒性T细胞(CTL)应答，抑制肿瘤细胞诱导的血管生成，有显著的抗肿瘤转移作用。Niethammer等报道，给小鼠口服由减毒沙门氏菌携带的VEGFR2 DNA疫苗能打破对VEGFR2的自身免疫耐受，诱导针对VEGFR2的C11L应答，抑制肿瘤诱导的新生血管形成，在多种肿瘤模型中能抑制自发性和实验性肺转移灶的形成，该疗法对伤口有轻微影响，而不影响造血和生育。Nair等报道，用VEGFR2 mRNA转染的DC免疫小鼠能诱导针对VEGFR2的CTL应答，部分抑制肿瘤诱导的新生血管生成，抑制肿瘤的转移。

我们曾研究IFN-γ对体内最为重要的抗原提呈细胞——DC分化发育的调控，发现IFN-γ是DC分化发育和功能成熟的自分泌因子，IFN基因转染能促进Dc的分化发育和功能成熟，IFN-γ基因修饰的DC其诱导Thl型免疫应答的能力显著增强。瘤内注射IFN-γ基因修饰的Dc能增强Dc的抗肿瘤作用。考虑到IFN-γ本身也是新生血管形成的负调控因子，Pan构建了表达小鼠VEGFR2胞外区(sVEGFR2)与IFN-γ融合蛋白的重组表达质粒pcDNA3．1／sVEGFR2一IFN-γ，结果发现，该重组质粒所表达的融合蛋白同时具有sVEGFR2和IFN-γ的生物学活性，sVEGFR2一IFN-γ基因转染的DC免疫小鼠能显著增强针对VEGFR2的CTL应答，与sVEGFR2基因转染的DC相比，该融合基因修饰的DC免疫接种能更加强烈地抑制肿瘤细胞诱导的血管生成、抑制肿瘤的转移。Wada等筛选了与人HLA—A木0201具有较高亲和力的VEGFR2抗原肽，发现该抗原肽能成功诱导特异性CTL应答，继而构建了表达HLA—A jl：0201的转基因小鼠A2／Kb，该小鼠的血管内皮细胞不仅表达VEGFR2，还表达人MHC I类分子。A2／Kb小鼠注射HLAAjl：0201限制性的VEGFR2多肽疫苗后，ELISPOT检测特异性表达IFN-γ的CTL，得到阳性结果；在肿瘤模型中，以VEGFR2抗原肽疫苗免疫小鼠，与不表达HLA—Ajl：0201的正常小鼠相比，A2／Kb转基因小鼠的肿瘤生长明显受抑。检测肿瘤组织中的血管新生，发现VEGFR2抗原肽免疫的小鼠血管生成明显抑制。为了进一步研究能否在人体诱导VEGFR2特异性的CTL应答，用VEGFR2抗原肽疫苗刺激从6位癌症患者分离的外周血单个核细胞，结果发现，所有患者的淋巴细胞均对该抗原肽有应答，产生一定量的IFN-γ，被成功诱导出VEGFR2特异性的CTL，对表达VEGFR2的靶细胞具有显著的细胞毒作用。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF／FGF2)是一种重要的促血管生成因子，它由肿瘤细胞、巨噬细胞产生或由细胞外基质释放，并以自分泌或旁分泌的方式发挥作用。它能够上调一些重要的促血管生成因子如VEGF以及纤溶酶原激活物，并通过Bel-2途径抑制内皮细胞凋亡。bFGF主要通过与其高亲和性受体——成纤维细胞生长因子I型受体(FGFR1)的结合来发挥其生物活性。Plum等研究发现，合成的FGF2肝素结合结构域肽段和受体结合结构域肽段在体外均能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，随后将上述两种肽段以脂质体为佐剂分别免疫小鼠，发现接受肝素结合域肽疫苗免疫的小鼠体内产生了针对FGF2的特异性抗体，该抗体能够抑制FGF2与硫酸肝素的结合，抑制了明胶海绵模型的肿瘤血管生成，并在肿瘤转移模型中抑制肿瘤的生长。最近的研究发现，针对FGF2的特异性抗体不影响伤口愈合和生育。

表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的膜表面传感器，广泛分布于哺乳类动物的细胞膜上。EGFR在生理状态下是细胞生长的调节因子，与其配体(如EGF)结合后发挥生理效应，调节细胞的分裂、分化和增殖，其过度表达与细胞的癌变有关。Hu等用重组的小鼠EGFR胞外区冲击DC(DC—edMER)，用该致敏DC免疫小鼠在脾细胞中检测到较多数量的表达特异性抗EGFR抗体的细胞，血清中发现较高浓度的抗体，同时能诱导特异性CTL应答。在肿瘤模型中，DC—edMER免疫的小鼠肿瘤血管生成受抑制，肿瘤生长减慢，荷瘤小鼠的生存期延长。

4 小结

抗肿瘤血管生成主动免疫治疗作为肿瘤治疗的一种新方法。近年的研究成果展示出令人鼓舞的应用前景，虽然与传统治疗方法相比具有诸多优点。但仍有不足和缺陷。首先，肿瘤生长早期，当肿瘤直径小于2—3 mm时，肿瘤细胞依靠单纯的被动扩散即可获得生长所需的氧和营养成分，因此，单纯的抗血管生成不能彻底根除肿瘤；其次，尽管目前抗血管生成主动免疫治疗所选用的靶点较特异，但仍有一些潜在的副作用，如影响伤口愈合，影响女性月经周期等，并且其在儿童肿瘤的应用上有局限性。因此，随着分子生物学和免疫学的发展，通过多种方法发现更多的肿瘤特异性内皮细胞标志，并以该内皮标志为抗肿瘤血管生成主动免疫治疗的特异性靶点，将是今后的研究重点。这些方法有：基因表达系统分析的方法(SAGE)分析正常内皮细胞和增殖内皮细胞的基因表达、噬菌体展示技术发现新的内皮细胞受体、蛋白质组学的方法发现调节内皮细胞生长的肽段或蛋白质等。以抗肿瘤血管生成主动免疫治疗的特异性靶点将是今后的研究重点。此外，如何构建疫苗打破自身免疫耐受，诱导有效的免疫应答仍是需解决的重要问题。随着上述问题的不断解决，抗肿瘤血管生成主动免疫治疗将日臻完善。

参考文献(略)