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内源性血管生成抑制剂

2010-01-06 17:08:03 作者：新特药房来源：中国新特药网浏览次数：70 文字大小：【大】【中】【小】

简介： 内源性血管生成抑制剂 JUDAH FOLKMAN APMIS 112: 496–507, 2004 2004 年2 月，FDA 委员宣布认可Avastin 作为结肠癌患者的治疗方法，称血管生成抑制剂是抗癌治疗的第四种方案。与传统化疗相比，血 ...

关键字：内源性血管生成抑制剂

内源性血管生成抑制剂

JUDAH FOLKMAN

APMIS 112: 496–507, 2004

2004 年2 月，FDA 委员宣布认可Avastin 作为结肠癌患者的治疗方法，称血管生成抑制剂是抗癌治疗的第四种方案。与传统化疗相比，血管生成抑制剂毒性小，且发生耐药的危险性低，他们代表了新种类的抗癌药物，其中一些抑制剂的毒性被充分的降低，所以长期使用是安全的。包括免疫治疗、疫苗、端粒酶抑制剂、细胞死亡诱导剂、低剂量metronomic 化疗、新颖的激素治疗、基因治疗和其他。在循环和/或细胞外基质中至少发现了16 种内源性血管生成抑制剂。血管生成抑制剂的应用可能会变成最安全、毒性最小的抗癌治疗法。四种血管生成抑制剂已经应用于治疗肿瘤的临床试验中。目前，有报道口服一些小分子（FDA已认可他们的其他用处），能明显增加人体和老鼠中至少两个内源性血管生成抑制剂水平，人体中为内皮抑素、老鼠中为血小板反应素。该发现提示未来一些新的临床应用，包括通过目前正在发展的血液或尿液中的生物标记指导血管生成抑制剂的使用，这些生物标记能在肿瘤表现出症状之前或可用常规方法找到肿瘤之前发现肿瘤的存在。

关键词：内源性血管生成抑制剂；血管生成抑制剂；抗血管生成治疗；metronomic化疗

美国食品药品协会已认可血管生成抑制剂为癌症的治疗方法，那我们应该考虑这些新的治疗性因子未来的应用。在三种常见的血管生成抑制剂中，那些作用于单个血管源性介质如VEGF 的抑制剂，当与其他血管生成抑制剂或与低剂量的metronomic 化疗一起给药时可能有效。因为相对于传统的化疗，血管生成抑制剂的毒性较低，并且发生耐药的危险性较低，所以运用血管生成抑制剂治疗可能超越传统化疗。比如，在肿瘤表现出症状之前或用常规的方法可以局限住肿瘤前，如果血液或尿中的生物标记可以诊断出癌症的存在，那这些副作用最小的血管生成抑制剂会是最适合的治疗选择。这并不是指预防癌症的唯一方法是抗血管生成治疗。然而抗血管生成治疗被认为是新型的抗癌方法，其中的一些毒性充分的减少，长期使用是安全的。包括免疫疗法、疫苗、端粒酶抑制剂、凋亡诱导剂、新颖的激素疗法、基因疗法及其他。所有抗癌治疗方法中最安全、毒性最小的可能是内源性血管生成抑制剂。他们是本文的讨论重点。

血管生成抑制剂：从实验室到临床应用

1971 年发表了关于肿瘤生长是血管生成依赖性的假说，这开始了人们对于血管生长过程的研究[1，2]，最终吸引了全世界上千万的研究者。1973 年内皮细胞首次在活体外传代成功[3，4]，随后发展了血管发生的生物学鉴定方法[5，6]，发现了血管源性蛋白以及首个血管生成抑制剂[11-19]，血管源性蛋白包括成纤维细胞生长因子bFGF, aFGF [7，8],血管内皮细胞生长因子VEGF[10],血管通透性生长因子VPF[9]及其他[6]。1988 年，一个患威胁生命的肺多发性血管瘤的患者第一个接受了抗血管生成治疗，目前身体健康[11，12]。整个90年代，开始了应用每天低剂量α干扰素治疗患威胁生命的血管瘤的儿童和患成血管细胞瘤和高级别的巨细胞瘤的各种年龄的患者[20-23]。1994 年有报道反应停是一种血管生成抑制剂[19]，1999 年报道反应停首次成功用于临床治疗多发性骨髓瘤[24]。2004 年2 月，FDA 认可了Avastin，Avastin 是在大样本、多中心、随机、安慰剂对照的临床试验中被证实的第一个血管生成抑制剂，可延长转移性结肠癌患者生存率[25]。关于血管生成的临床试验和基础研究都在继续开展。自1971 年起，有超过20000 的关于血管生成的文章发表。在美国，有超过30 种的血管生成抑制剂正在进行癌症治疗的临床试验，也见于关于黄斑变性和糖尿病视网膜变性的临床试验，不包括全世界已经在用的其他血管生成抑制剂[图一]。

归纳一下，这些血管生成抑制剂可分为两类，一些专门抗血管生成的，如Avastin，VEGF-Trap，另一些除了抗血管生成的功能外还有其他功能（称多效的）。事实上，一些多效的血管生成抑制剂在被发现他们有抗血管生成的功能前已被FDA 认可了其他的功能，如塞来考昔（抗关节炎药，COX-2 抑制剂）。其他的也已在研究者发现他们的抗血管生成的功能前被用于临床试验。然而，在FDA 认可他们时，他们的抗血管生成的功能还没有被临床医师广泛了解。比如Velcade，是一种蛋白体抑制剂，但在动物模型中具有有效的抗血管生成的功能[26-28]。Iressa 和Erbitux，在肿瘤细胞中阻断EGF 受体酪氨酸激酶的功能已被FDA认可。该功能导致了肿瘤细胞表达VEGF, bFGF,和 α-TGF 下降[29]。目前在临床试验中发现Tarceva 有类似的作用。跟在肿瘤细胞中一样，ZD6474 在内皮细胞中也阻断了EGF 受体酪氨酸激酶。α-TGF 上调了内皮细胞受体[30]。对目前已发现的抑制血管生成的药，抗血管生成的机制尚不清楚。例如，在反应停被证实在小鼠角膜上可抑制血管生成之后[19]，后续有报道反应停在多发性骨髓瘤病人中，也可以减少VEGF 的表达并减少循环中过度生产的内皮细胞前体物质至正常水平[31，32]。

图1 一些正在进行临床试验或已得到美国FDA 批准的血管生成抑制剂。左侧列包括那些只有单一功能的血管抑制药物。右侧列包括除了抗血管生成功能外还有其他功能的药物。其中九种在发现还具有血管生成抑制作用前是因为其他的活性而被FDA 批准。西乐葆[71，72]和唑来膦酸[78]是其中的例子。

目前临床上血管生成抑制剂的类型

为了区别用于患者的血管生成抑制剂如何不同，我们定义了三种常见类型的血管生成抑制剂[图二]。Ⅰ型抑制剂阻断单个血管源性蛋白，如Avastin 中和了由肿瘤细胞和/或瘤床上的基质细胞产生的VEGF。VEGF 是抗血管生成治疗的一种有效靶因子，大约60%的人体肿瘤产生VEGF。然而，当肿瘤病人生存时间更长时，由于肿瘤细胞突变，可能会有过多的血管源性蛋白出现的危险。如第一次诊断时大多数乳腺癌只产生VEGF，而其他的乳腺癌特别是复发性肿瘤，产生多至五种其他的血管生成因子[33]。因此，随着时间的发展，一些Ⅰ型血管生成抑制剂可能出现获得性药物耐药。然而，这似乎是由肿瘤或他相关的基质细胞产生的另外的血管源性蛋白导致的，这些蛋白不是Ⅰ型血管生成抑制剂的作用对象。通过在开始时联合其他血管生成抑制剂或联合抗血管生成化疗（低剂量或metronomic 化疗），可避免这种对Ⅰ型血管生成抑制剂的无应答性的现象[34-36]。传统化疗也可联合抗血管生成治疗，但最大耐受剂量的化疗使组织因子的表达增加，超过了在肿瘤病人中的正常高值。这个方案中附加的抗血管生成治疗可能与血栓性疾病和心肌梗塞的危险性上升相关[37，38]。

图2 依据是否抑制一种或是多种血管生成蛋白，血管生成抑制剂的一种可行的分组方法Ⅱ型血管生成抑制剂阻断两种或三种血管源性蛋白。例如，Iressa 阻断肿瘤细胞产物VEGF, bFGF,和 α-TGF，而Sugen5416 阻断VEGF 受体。这些抑制剂联合其他血管生成抑制剂给药或联合低剂量metronomic 化疗给药效果会增加。Ⅲ型血管生成抑制剂是具有广谱抗血管源性蛋白功能的。如TNP-470，一种烟曲霉素的类似物，可能具有最广的抗癌活性，它具有任何一种血管生成抑制剂的活性。超过400 篇报道显示在裸鼠、老鼠、仓鼠和兔子上的超过84 种不同类型的肿瘤，包括长在裸鼠身上的人肿瘤，40%-100%被抑制。这种抑制剂在临床Ⅰ期试验中非常有效，但在高剂量时有神经毒性，所以在Ⅱ期试验中未继续下去。然而，现在将它与一聚合物（羟丙基异丁烯酰胺）结合后，显示无毒性且更有效[39]。内皮抑素是一种内源性血管生成抑制剂，其在血管内皮上的功能性的受体是α5β1[40，41]，但内皮抑素似乎也通过减少再生内皮细胞中αⅤβ3 整连蛋白抑制肿瘤。还显示自己注射抑素他丁超过2.5 年的患者未出现内皮抑素毒性，那些转移性的疾病依然稳定或缓慢复原。

总之，血管生成抑制剂可抑制肿瘤细胞产生血管源性蛋白（如Iressa、Erbitux、α干扰素），或阻断受体与这些蛋白的相互作用，或中和蛋白本身，或直接作用于肿瘤床微血管内皮细胞，通过其他机制抑制迁移和增殖（如内皮抑素）[42]。

内源性血管生成抑制剂

在70 年代晚期，本实验室长期致力于证实血管生成抑制剂的存在，因为几乎没有科学家相信此种分子的存在。从1980-2003 年，我们先后报道了11 种血管生成抑制剂。5 种新发现的分子和6 种先前未发现其抗血管生成功能的分子[图三][11-19，43-45]。其中的五种目前已用于临床试验中的不同阶段，其中的八种是内源性血管生成抑制剂。

图3 1980 年到2003 年在Folkman 实验室发现的11 种血管生成抑制剂。

1980 年，本实验室中的Bruce Zetter 首次揭示α干扰素在剂量依赖下，能可逆的抑制内皮细胞迁移[13]。这导致了其后来被称为血管生成抑制剂[46，47]。1988 年[11，12]，α干扰素成功的用于完全或持久复原威胁生命的肺血管、脑血管瘤、婴儿气道或肝的血管瘤、对传统治疗耐受的复发性的高级别的巨细胞瘤和成血管细胞瘤[20-23][48-50]。这些肿瘤都表达高水平的bFGF 作为他们主要的血管源性中介物。α干扰素抑制bFGF 产物讯息和人癌细胞产生的蛋白[51]。β干扰素，商业上有效的α干扰素的活体内副本，是第一个被发现的内源性血管生成抑制剂。目前至少有15 种这样的内源性抑制剂[图四]。

图4 目前所知内源性血管生成抑制剂。

然而，我们不能立刻识别这些分子有内源性血管生成抑制剂的潜在功能，直到后来发现了血管抑素[17]。血管抑素作为体内一更大蛋白（纤维蛋白溶酶原）的片段，是第一个被发现的内源性血管生成抑制剂。内皮抑素作为基质蛋白——胶原ⅩⅧ的内部的片断，是第一个被发现的内源性血管生成抑制剂[18]。见引文中的综述[6]。

内源性血管生成抑制剂预防病理性血管发生的遗传学证据

一些研究证实了体内的血管生成抑制剂能帮助抑制病理性血管发生[52，53]。波斯顿Beth Israel 医院的Raghu Kalluri 和他的同事报道了令人瞩目的证据。他们发现tumstatin，胶原Ⅳα链上的一个232 氨基酸多肽，能有效的抑制血管生成[54]。在胶原Ⅳ上α3 链缺如的动物身上，正常血中tumstatin 水平为0 ng/ml -336+-28 ng/ml。肿瘤种植在tumstatin 缺如的老鼠身上，生长速度比在野生型老鼠身上快3-4 倍。然而，如果tumstatin 换回到生理学水平，在α3 链缺如的老鼠身上肿瘤生长速度减慢，比野生型老鼠还慢。这显示在野生型老鼠中肿瘤不是升级速率生长的，但他们的生长率被内源性tumstatin 部分抑制。若加入药理学剂量的tumstatin，肿瘤生长明显被抑制，并低于肿瘤在野生型老鼠上的生长速度。除了tumstatin是单纯的抗血管生成、至今不知道其他功能之外，这验证了经典的观点：肿瘤抑制蛋白如p53。此外，在tumstatin 缺如的老鼠身上比野生型老鼠身上的循环内皮细胞水平高10 倍，但加入tumstatin 替代可降至正常水平[55]。发现αⅤβ3 是tumstatin 的功能性整合蛋白[42]，α5β1 是内皮抑素的功能性整合蛋白[41，42]。Tumstatin 抑制来自αⅤβ3+/+的老鼠的内皮细胞中DNA 的合成，但不能抑制来自αⅤβ3-/-的老鼠的内皮细胞中DNA 的合成。内皮抑素在两种老鼠系中都可以抑制DNA 的合成。在皮下植入基质胶，发现相似的反应发生，对抗VEGF 导致的血管生成。Tumstatin 抑制血管生成作用只出现在β3+的老鼠中，但在β3-的老鼠中无该作用，而内皮抑素在两种老鼠系中都可以抑制血管生成。在另一个实验中，在金属蛋白酶-9 缺失的老鼠中，因为金属蛋白酶-9 间接的从胶原Ⅳ上将Tumstatin 分裂出来，Tumstatin 血液水平被降低了约40%。在这些老鼠中，植入的肿瘤生长明显增快，但如果tumstatin 替代到生理学水平，肿瘤生长减低到比在野生型老鼠中更慢。总之，当血管生成抑制剂被阻断，或他的受体被阻断或从他的基质蛋白释放配基的酶被阻断，所有操作可预知的显示同样的效应：血管生成增加、肿瘤生长增加、tumstatin 替代到生理学水平后肿瘤生长速度可恢复至在野生型老鼠中的水平。血小板反应素-1 是一种内源性血管生成抑制剂。在血小板反应素-1 缺失的老鼠中肿瘤生长速度明显快于在野生型老鼠中[56]。因此，内源性血管生成抑制剂，如p53，在正常情况下可能对肿瘤提供另外的预防。事实上，p53 通过四种不同的机制抑制血管生成。1.上调血小板反应素-1 的表达[57]2.降低缺氧诱导因子-1-[58]3.抑制VEGF 表达4.下调bFGF 关联蛋白表达[60]。

内源性血管生成抑制剂可能有肿瘤抑制基因功能的临床证据

Down 综合症的患者即使存活到中年或更老，他们实体肿瘤的发病率也非常低[61]。在美国，对17897 名Down 综合症患者进行人口调查研究，所有实体癌的发生率低于0.1，除了睾丸癌是跟正常人群同样概率。在儿童中白血球过多症的发病率增加。由于21 三体中胶原ⅩⅧ三倍体的出现，Down 综合症的患者也有明显的高水平的循环内皮抑素。正常受试者血清内皮抑素浓度为20+-11 ng/ml，相对的，Down 综合症的患者中为39+-20 ng/ml。作者总结，“增加正常内皮抑素量的1/3 可能是有效的治疗剂量，可明显的抑制许多实体肿瘤”。糖尿病性视网膜病在Down 综合症的患者中少见[63]，动脉粥样硬化也少见[64]。有报道在载脂蛋白E 缺失的小鼠中，动脉粥样硬化的斑块的生长依赖于这些斑块的新生血管的形成。运用内皮抑素，相对于未治疗组，可抑制高达85%的斑块生长。遗传缺失胶原ⅩⅧ，并后续缺失内皮抑素，增加了动脉粥样硬化中新生血管的形成和脉管的通透性[66]。VEGF 增加了血管内皮细胞中神经钙蛋白的表达[67]，但VEGF 也增加了Down 综合症关键区蛋白-1 的表达，该蛋白下调了神经钙蛋白的表达，因此有中和VEGF 导致的神经钙蛋白表达增加的倾向。上调神经钙蛋白的表达对内皮细胞增殖是必要的。可以设想内皮抑素下调内皮细胞中的神经钙蛋白的表达，VEGF 刺激的Down 综合症关键区蛋白-1 也部分介导内皮细胞中的神经钙蛋白的表达，因此在Down 综合症中可能有另一个复制。

内源性血管生成抑制剂能增强药理性吗？

来自Down 综合症患者的资料显示，循环的内皮抑素水平可能与遗传学有关。这提出了问题：用小分子特别是用口服的有效的小分子是否可能导致图四中列出的任何一种内源性血管生成抑制剂的增加。多次低剂量化疗给药能增加内源性血管生成抑制剂，该效应是独立于用药的。该研究是我们实验室的Timothy Browder 开始的[34]。Browder 报道指出当开始治疗癌体积为100-650mm3 的路易斯肺癌时，传统的化疗如按传统的最大耐受剂量计划表给予环磷酰胺，为保证骨髓的修复治疗间隔为三周，这导致了在所有肿瘤对药的耐药[34]。相反的，当更频繁，更低剂量给予环磷酰胺治疗时，他的作用如同血管生成抑制剂。在肿瘤细胞细胞死亡开始的前4 天，肿瘤血管床增殖的内皮细胞经历一段细胞死亡的波动。所有肿瘤完全退化，动物保持无肿瘤状态，拥有正常寿命（高达657 天）。

当肿瘤对环磷酰胺耐药时，与传统方案（最大剂量）给予环磷酰胺相比，仍然有明显的肿瘤抑制作用。当加入另一个血管生成抑制剂TNP-470 时，有持久的肿瘤退化，贯穿了动物的正常生命期。相反的，所有用传统方案（最大剂量）给药——环磷酰胺的动物死于肿瘤耐药。

该研究由多伦多Robert Kerbel 的实验室证实，他们用不同的化疗治疗药物，长春碱，联合不同的血管生成抑制剂DC101 给药。DC101 是VEGF 受体2 的抗体[36]。换句话讲，抗血管生成化学治疗如频繁、低剂量给予环磷酰胺，导致肿瘤床微血管内皮细胞优先死亡，优化了药物的抗血管生成能力，降低了药物的毒性，事实上消除了获得性的环磷酰胺耐药的发生。

在另一个实验中，当小鼠接受给予剂量的内皮抑素，用渗透泵超过24 小时连续给药。其抑制人胰腺癌生长的有效性是一次性给予同样大剂量治疗方案的10 倍[68]。事实上，肿瘤退化只有在连续给药时才会达到。频繁、低剂量的化疗可能与暴露肿瘤床内皮细胞以持续的内皮抑素治疗相似。Browder 称该方法为抗血管生成治疗，暗示可通过改变剂量和给药时间使化疗药物的抗血管生成活性达到最大。在一篇评论中，Douglas Hanahan 创造了术语metronomic 治疗以指明新的治疗方案。该术语现在已被广泛运用。许多种关于抗血管生成的临床试验，低剂量化疗目前正在进行中[69]。随后，Kerbel 实验室在移植有肿瘤的老鼠的饮用水中加入低剂量metronomic 环磷酰胺，证实95%的肿瘤生长被抑制，这些肿瘤生长与循环血小板反应素-1明显增高相关[70]。在血小板反应素-1 缺乏的小鼠中低剂量metronomic 化疗是无效的，这提示低剂量口服化疗部分依赖于其导致循环血小板反应素-1 增加的能力。这个结果使我质疑：是否其他任何经口服释放的小分子都能导致循环内源性血管生成抑制剂水平的增加。

如果某一个内源性血管生成抑制剂在血液中能被增加，那将模拟持续给予抑制剂治疗。有报道塞来考昔是血管生成抑制剂[71]。随后，有报道塞来考昔和罗非考昔通过自血小板中释放内皮抑素增加循环内皮抑素[72]。低剂量doxycyline，而不是四环素，在抗酸转染的人肿瘤细胞中增加了血小板反应素-1[73]。Doxycyline 与威胁生命的肺血管内皮细胞瘤的完全退化相关[50]。罗格列酮，一PPAR(过氧化物酶体增生物激活受体)γ配基，也被报道可导致循环血小板反应素-1 以及他的受体CD34 增加[74，75]。此外，关节炎的标准治疗，柳氮磺胺吡啶和氢化泼尼松，导致了滑膜关节中内皮他定的增加和VEGF 的减少。

归纳起来，至少五种小分子（他们在其他疾病的广泛运用已全被FDA 认可）能增加内源性内皮他定或血小板反应素-1 的水平[图五]。我已经报道对移植有肿瘤的老鼠给药——罗格列酮，可预防初发肿瘤切除后的肺部转移肿瘤的生长[75]。因此，应该慎重考虑在重度联合免疫缺陷病免疫耗竭患者中，是否可通过提高循环内源性血管生成抑制剂水平逆转或是预防肿瘤生长。

图5 口服给药的小分子化合物（它们都是FDA 批准的，没有相关毒性）提高血液循环中某些内源性血管生成抑制剂的图解。这一图示也揭示了发现一些小分子的可能，它们可以提高如alphastatin、TIMP-2 和tumstatin 这一列表中其他血浆内源性血管生成抑制剂的水平。为预防非血管源性原位肿瘤向血管源性肿瘤的转变或为了治疗在症状出现数年前显微镜下血管源性肿瘤，增加内源性血管生成抑制剂可能是长期抗癌治疗中最安全的方法。在不久的将来，当生物标记能在肿瘤未扩散前检测出肿瘤的存在（如引文[76]和[77]中的原型），增加内源性血管生成抑制剂的治疗方法将变得可行。生物标记可指导这种新奇的治疗方式，而不需要等到肿瘤长到传统的成像法能检测到的大小。生物标记目前用于来自心脏病学的模型，如血浆胆固醇和C 反应蛋白，来指导抑制素治疗动脉粥样硬化，而不需要知道斑块的解剖学定位。

文献：参照原文