【摘要】 
目的:构建人乳头瘤病毒（HPV）16型衣壳蛋白L1与癌胚抗原（CEA）细胞毒T细胞（CTL）表位嵌合基因，探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:选择CEA CTL表位（CEA691 IMIGVLVGV），以HPV16阳性宫颈癌组织提取的DNA为模板，通过PCR方法扩增出HPV16 L1/CEA CTL表位嵌合基因，克隆入pET32a(+)表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达融合蛋白，通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化，进一步采用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。结果:pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组质粒构建成功，并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE分析表明表达产物分子质量（Mr）约为83×103, 与预期相符，Western-blot方法进一步证实其为目的蛋白。结论:利用pET32a(+)表达载体能表达HPV16 L1/CEA CTL表位重组蛋白，为其进一步的免疫效应研究打下了基础。

【关键词】  乳头状瘤病毒；癌胚抗原；原核表达；T淋巴细胞，细胞毒性

       Abstract:  Objective:To construct the chimeric gene of HPV16 capsid protein L1 and CEA CTL epitope and to explore the protein expression of it in Escherichia coli. Methods: The CEA CTL epitope （CEA691 IMIGVLVGV）was selected and the chimeric gene of HPV16 L1/CEA CTL epitope was amplified by PCR. The chimeric gene was cloned into the expression vector pET32a(+) for forming the pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL epitope recombinant with which is transformed E.coli BL21. The pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL epitope fusion protein was expressed in E.coli, induced by IPTG, and purified by Ni-NTA agarose column ion-exchange chromatography. The protein was analyzed with SDS-PAGE and identified with Western-blot. Results: The pET32a(+)/HPV16 L1/CEA-CTL epitope recombinant plasmid was successfully constructed and the fusion protein could be expressed in prokaryotic expression system, SDS-PAGE analysis showed the relative molecular mass of this fusion protein as 83×103，which was consistent with that of theoretically predicted, and the specificity of this fusion protein was comfirmed with Western-blot. Conclusion: The fusion protein of the HPV16 L1/CEA-CTL epitope chimeric gene can be successfully expressed in prokaryotic expression system, It lays the foundation for the detecting its immunity effectiveness.

    Key words:  papillomavirus; carcinoembryonic antigen; prokaryoti expression; T lymphocyte, lytotoxic

    癌胚抗原（carcinoembryonic antigen CEA）是一种重要的肿瘤相关抗原，在绝大多数结直肠癌和胃癌、50%乳腺癌及70%非小细胞肺癌中有较高的表达[1，2]，以CEA抗原为基础的疫苗是目前防治CEA相关肿瘤研究的热点，而增强CEA CTL表位的免疫原性仍是迫切需要解决的问题[3，4]。目前研究表明，人乳头瘤病毒（human papillomavirus HPV）结构蛋白L1可携带外源蛋白，是非常良好的抗原载体，能保持L1和外源蛋白的免疫原性和抗原性不变[5]。本研究利用HPV16 L1作为CEA CTL表位的载体，通过原核表达系统研究该嵌合蛋白的表达，为增强CEA CTL表位疫苗免疫原性提供一条新的途径。

    1  材料和方法

    1.1  标本来源  宫颈癌标本来源于温州医学院第二附属医院妇产科，经PCR检测鉴定为HPV16阳性标本，由本室保存。

    1.2  菌株和质粒  pET32a(+)质粒菌株、大肠杆菌（E.coli）BL21(DE3)、DH5α菌株由本室保存，pMD18-T vecter 质粒购自TaKaRa公司

    1.3  酶和试剂  组织DNA提取试剂盒、DNA Marker(DL2000) 和T4DNA 连接酶均购自TaKaRa公司；DNA Marker(λ/HindIII )、HindⅢ酶、BglⅡ酶、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、Ni-NTA蛋白纯化胶、预染蛋白质Marker购自MBI公司；小规模质粒提取试剂盒和琼脂糖胶DNA纯化回收试剂盒购自杭州维特洁公司；6×His单克隆抗体为ABR公司产品；辣根过氧化酶（HRP）标记山羊抗兔IgG(H+L)购于杭州联科生物公司；DAB显色剂购于北京赛驰生物科技有限公司。

    1.4  HPV16 L1 DNA的提取  用组织DNA提取试剂盒从本实验室保存的宫颈癌组织中提取HPV16 DNA。

    1.5  引物设计与合成  根据HPV16 DNA序列设计特定引物，同时根据pET32a(+)质粒引入酶切位点。正向引入的酶切位点为 BglⅡ（AGATCT），反向引入的酶切位点为HindⅢ（AAGCTT）。正向引物为 5' GAAGATCTGATGCAGGTGACTTTTATTTAC 3'，反向引物为5'CCCAAGCTTAACCCCAACC AGCACTCCA ATCATGATCAGCTTACGTTTTTTGCG 3'。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

    1.6  HPV16 L1/CEA CTL表位嵌合基因的扩增  以HPV16 DNA为模板，用上述设计的引物通过PCR扩增出HPV16 L1/CEA CTL表位嵌合基因。PCR反应体系：HPV16 DNA模板 1μl，引物各0.5μl，PCR反应液25μl，双蒸水23μl，共50μl；PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；然后95 ℃变性，50 s，53 ℃退火50 s，72 ℃延伸80 s，循环34次；再72 ℃延伸5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用DNA 胶回收试剂盒纯化PCR产物。

    1.7  pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组质粒的构建与鉴定  将纯化的PCR产物亚克隆到pMD18-T载体，构建pMD18-T/HPV16 L1/CEA CTL表位重组质粒，转化E.coli DH5α，提取重组质粒，经BglⅡ、HindⅢ双酶切鉴定。然后将鉴定的重组质粒，克隆到pET32a(+)载体，构建pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组表达质粒，转化E.coli DH5α，经培养质粒提取，通过酶切和序列检测（北京三博远志生物技术有限责任公司）鉴定。

    1.8  pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组质粒的原核表达  将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，经37 ℃培养24 h，提取质粒经电泳鉴定。挑取单个菌落，培养并以不同IPTG浓度（0 mmol/L、0.3 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0 mmol/L、3.0 mmol/L、4.0 mmol/L、5.0 mmol/L），不同诱导时间（0 h、1 h、3 h、7 h、12 h、20 h），不同诱导温度（18 ℃、25 ℃、28 ℃、32 ℃、37 ℃），选择目的蛋白的最佳诱导表达条件。

    1.9  pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组蛋白的分析鉴定  将经诱导后的细菌上清与沉淀分别行10% SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，分析蛋白的表达和分布情况。将已行电泳SDS-PAGE膜上的蛋白转醋酸纤维膜作Western-blot分析鉴定，用5%牛奶/TBS-T 4 ℃封闭过夜，加入6×His兔单克隆抗体37 ℃孵育1 h，加入辣根过氧化酶（HRP）标记山羊抗兔IgG(H+L)）37 ℃孵育1 h，用二氨基联苯胺（DAB）显色，至出现条带后立即中止反应。
1.10  pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组蛋白的纯化  重组菌株在最佳条件（37 ℃、IPTG浓度为0.3 mmol/L）下诱导3 h，离心收集细菌，冰浴30 min，按QIAGEN公司提供的6-His标签蛋白表达和纯化手册进行Ni-NTA离子交换柱层析纯化蛋白，进一步用SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。

    2  结果

    2.1  HPV16 L1/CEA CTL表位嵌合基因的PCR扩增结果  PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，可见1.77 kb左右条带，分子量大小与预期一致（图1）。

    2.2  pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组质粒的鉴定  重组质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切，见约5.9 kb与1.77 kb两条带（见图1）；碱基测序完全正确，表明重组质粒构建成功。

    2.3  pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组质粒的原核表达条件  重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后，在不同温度、不同IPTG浓度、不同诱导时间诱导后经SDS-PAGE检测都有蛋白表达。在37 ℃、0.3 mmol/L IPTG浓度、3 h诱导时间条件下，重组质粒的表达量最大。

    2.4  pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组蛋白的分析  重组蛋白经10% SDS-PAGE分析可见83 kd蛋白条带，约占菌体总蛋白的10%左右。经Western-blot分析鉴定为目的重组蛋白（图2、3）。

    2.5  pET32a(+)/HPV16 L1/CEA CTL表位重组蛋白的纯化鉴定  重组菌株诱导后经Ni-NTA离子交换柱层析纯化可得到较纯（90%）的融合蛋白，经Western-blot分析鉴定为目的蛋白（图3）。

    3  讨论

    HPV感染不仅与生殖道肿瘤密切相关，近年报道其与消化道恶性肿瘤的发生亦有一定关系，尤以食道癌、直肠癌和胃癌组织中的检出率为高，且以高危型HPV16、18型为主[6，7]。HPV 结构蛋白L1基因在真核细胞表达系统中可形成不含病毒DNA的病毒样颗粒（virus like particles，VLPs），刺激机体产生特异性的免疫效应，从而起保护机体免受HPV感染的作用。研究发现在HPV L1的羧基端插入一定数目的多肽不会影响其自身结构和抗原性，同时不影响外源蛋白的免疫原性[8]，因此可成为一良好的多肽抗原释放载体。

    CEA是一种最常见的肿瘤相关抗原和目前国际上公认的肿瘤标志物, 由Gold和Freedman于1965年首先在人结肠癌和胰腺癌组织中发现，在绝大多数结肠癌、直肠癌、胰腺癌和胃癌中都有高水平表达[2]，在非小细胞肺癌、乳腺癌和甲状腺癌中也有较高表达。CEA是黏附细胞膜的糖蛋白，且从此蛋白提呈的多肽被传递给MHCⅠ和Ⅱ分子后在体内可被作为免疫攻击的对象，因此CEA已成为研究肿瘤疫苗的靶抗原。Zhou等[9]报道HLA-A2限制性CTL表位(IMIGVLVGV)基因疫苗能诱导CEA-A2Kb双转基因鼠的CTL杀伤作用，从而打破外周T细胞对CEA的免疫耐受；Kawashima I等[10]报道CEA HLA-A2限制性的CTL表位（IMIGVLVGV），能被HLA-A2患者的外周血淋巴细胞识别，且在小鼠体内产生较强的CTL反应；Huang等[11]利用牛乳头瘤病毒（BPV）的病毒样颗粒携带CEA制备口服疫苗，在转基因鼠中诱发了特异性的CTL效应。尽管以CEA全基因或CEA肽为基础的几种疫苗在体外实验中能产生特异性的细胞毒性反应，但CEA抗原过弱仍是影响疫苗效应的主要原因。本实验室在前期研究中已经证明，HPV16感染与胃癌有一定的相关性[7]，因此，本研究选择来源于温州地区宫颈癌组织的HPV16 L1基因，以HPV L1作为CEA CTL表位释放的载体制备了融合目的蛋白，为下一步免疫效应研究和CEA阳性肿瘤的治疗性疫苗研究打下了基础。

【参考文献】
  [1] Norton JA. Carcinoembryonic Antigen.New Applications for an Old Marker[J].Ann Surg,1991,213(2):95-97.

[2] Thompson JA, Grunert F, Zimmerman W,et al. Carcinoembryonic antigen gene family: molecular biology and clinical perspectives[J]. J Clin Lab Anal,1991,5(5):344-366.

[3] Xiang R, Silletti S, Lode HN, et al. Protective immunity against human carcinoembryonic antigen (CEA) induced by an oral DNA vaccine in CEA-transgenic mice [J]. Clin Cancer Res,2001,7(Suppl 3):856s-864s.

[4] Huarte E, Sarobe P, Lu J, et al. Enhancing immunogenicity of a CTL epitope from carcinoembryonic antigen by selective amino acid replacements [J]. Clin Cancer Res,2002,8(7):2336-2344.

[5] Harro CD,Pang YY,Roden RB, et al. Safety and immunoge-nicity trial of HPV VLP vaccine [J]. J Natl Cancer Inst ,2001, 93(4):284-292.

[6] Shuyama K, Castillo A, Aguayo F, et al. Human papillomavirus in high- and low-risk areas of oesophageal squamous cell car- cinoma in China [J]. Br J Cancer, 2007,96 (10):1554-1559.

[7] 朱冠保,张丽芳,程骏,等.人乳头瘤病毒16及其血清抗体与胃癌相关性的研究 [J].中华普通外科杂志, 2000,15(12):755-757.

[8] Zhou J, Sun XY, Frazer IH, et al.Glycosylation of human papillomavirus type 16L1 protein [J].Virology,1993,194(1):210-218.

[9] Zhou H, Luo Y, Mizutani M,et al. A novel transgenic mouse model for immunological evaluation of carcinoembryonic antigen-based DNA minigene vaccines [J].J Clin Invest,2004 113(12):1792-1798.

[10] Kawashima I, Hudson SJ, Tsai V,et al. The multi-epitope approach for immunotherapy for cancer: identification of several CTL epitopes from various tumor-associated anti-gens expressed on solid epithelial tumors [J].Hum Immunol,1998,59(1):1-14.

[11]Huang Y , Fayad R, Smock A,et al. Induction of mucosal and systemic immune responses against human carcinoembryonic antigen by an oral vaccine [J].Cancer Res,2005, 65: (15)