【摘要】 
目的:探讨胃癌组织p21WAF1基因表达与组蛋白乙酰化的关系。方法:利用RT-PCR对53例原发性胃癌的癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜的p21WAF1 mRNA表达进行分析；同时对其中p21WAF1 mRNA表达失活或表达量不足癌旁和正常黏膜的1/2的7例患者进行乙酰化组蛋白免疫印迹分析。结果:①胃癌组织中的p21WAF1表达率和表达值均显著低于正常胃黏膜和癌旁组织。②p21WAF1表达水平在分化较好和分化较差的胃癌组织间差异没有显著性 (P＞0.05)，但在不同浸润深度及有/无淋巴结转移的胃癌组织中差异具有显著性 (P＜0.05，P＜0.01)。③ p21WAF1 mRNA表达失活或表达量不足癌旁和正常黏膜的1/2的7例患者中有5例（5/7，71.43%）总染色质乙酰化组蛋白H3表达水平明显低于其相应的癌旁和正常黏膜，甚至在检测水平以下。结论:胃癌组织p21WAF1的表达降低至少部分归因于组蛋白乙酰化水平的低下。

【关键词】  胃癌；p21WAF1；组蛋白乙酰化

    Abstract:  Objective:To investigate the relationship between p21WAF1 gene expression and histone acetylation in gastric cancer. Methods: p21WAF1 gene expression of cancer tissue, para-focus of cancer and normal tissue in 53 cases with primary gastric cancer were analyzed with RT-PCR, meanwhile, histone acetylation in 7 cases with p21WAF1 mRNA non-expression or expression less than half of para-focus of cancer and normal tissue were analyzed with Western blot hybridization. Results:① Both p21WAF1 expression ratio and value of gastric cancer were lower than those of para-focus of cancer and normal tissue. ② p21WAF1 expression level had no difference between well-differentiated and poorly-differentiated gastric cancer (P>0.05), but there was significantly difference in different invasion depth and had none lymph node metastasis (P<0.05, P<0.01). ③ The expression of acetylated histone-H3 in total chromatin of 5 cases (5/7, 71.43%) was significantly lower than those of para-focus of cancer and normal tissue corresponding to them, even under detective level. Conclusion: The lower expression of p21WAF1 in gastric cancer is partly due to lower level of histone acetylation.

    Key words:   gastric cancer；p21WAF1；histone acetylation

    胃癌的发生同其他肿瘤一样，有癌基因的过度表达和（或）抑癌基因的失活。而在基因表达的调控中，表观遗传修饰已经成为共识，主要内容包括染色质的组蛋白乙酰化。组蛋白通过其乙酰化/去乙酰化来调控基因的表达与沉默。目前关于组蛋白乙酰化修饰对p21WAF1基因表达的调控在胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等方面研究较多[1-3]，而在胃癌方面的研究报道甚少。本研究通过观察组蛋白乙酰化对p21WAF1基因转录和表达的影响，初步探讨p21WAF1基因在胃癌发生发展中的作用，以及染色质组蛋白乙酰化水平与p21WAF1基因表达的关系。

    1  材料和方法

    1.1  材料  2003年4月至2006年12月本院53例原发性胃癌病例，其中男34例，女19例；年龄33～80岁，平均（54.4±8.5）岁。TNM分期：Ⅰ期14例、Ⅱ期12例、Ⅲ期22例、Ⅳ期5例。根治切除47例，姑息性切除6例，所有患者术前均未经放疗与化疗。对所有病例进行癌组织取材的同时也切取其病灶周围5 cm以内的癌旁组织和10 cm以外的正常黏膜组织。

    1.2  主要试剂和设备  TRIzol Reagent购自美国Invitrogen Life Technologies，M-MLV逆转录酶和RNAsin购自美国Promeaga Biotech公司，6-随机引物和dNTP购自上海生物工程技术有限公司，焦炭酸二乙酯（DEPC）购自美国Sigma公司，PCR扩增仪由德国Biometra公司生产，Vilber凝胶成像分析系统由法国Lourmat公司生产，超低温冰箱（-80 ℃）由日本SANYO公司生产，紫外分光光度仪由美国Beckman公司生产，抗组蛋白H3 N端乙酰化单克隆抗体购自美国Sata公司。

    1.3  细胞提取方法  采用挤压通过不锈钢纱网的方法，制成单个细胞悬液，详细方法参照文献[4]。

    1.4  p21WAF1 mRNA表达的检测  采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定，所用引物序列利用Oligo 6.71软件进行设计，由上海生物工程公司合成。正向引物：CAGGGGACAGCAGAGGAAGA，反向引物：CGGCGGCCAGGTATGTAC。TRIzol一步法抽提细胞总RNA，逆转录聚合酶链反应依照试剂盒说明进行。PCR产物电泳后采用Vilber凝胶成像分析系统进行分析。

    1.5  乙酰化组蛋白的检测  采用蛋白印迹杂交法（Western blot hybridization），常规方法提取细胞核蛋白，取10μg蛋白，用15%聚丙烯酰胺作SDA-PAGE，常规方法做免疫印迹分析，单抗体浓度用1:2 000。

    1.6  统计学处理方法  所有统计检验均为双侧概率检验，P<0.05为差异有显著性。数据处理均采用SPSS13.0统计软件处理。

    2  结果

    2.1  p21WAF1mRNA在不同组织中的表达  正常胃黏膜组织中，p21WAF1mRNA表达率为100%；p21WAF1mRNA在癌旁组织中表达率为94.3%；在胃癌组织中表达率为69.81%。胃癌组织中p21WAF1 mRNA表达呈不同程度下调，其表达值显著低于癌旁组织和正常黏膜组织，具体见图1。

    2.2  p21WAF1mRNA表达与胃癌生物学行为的关系  总共53例胃癌中，根据其分化程度分为分化较好组与分化较差组；按浸润深度分为侵及黏膜、黏膜下层与侵及肌层、浆膜层组；按有无淋巴结转移分为两组。各组p21WAF1mRNA的表达情况见表1。

    2.3  p21WAF1 mRNA表达低下的癌组织中H3 N端免疫印迹分析  根据PCR产物凝胶电泳的密度扫描比较，53例病例中有7例p21WAF1 mRNA表达失活或表达量不足癌旁/正常黏膜的1/2 。对这7例病例进行乙酰化组蛋白免疫印迹分析，其中5例（71.43%）总染色质乙酰化组蛋白H3表达水平明显低于其相应的癌旁组织和正常黏膜组织，甚至在检测水平以下，具体见图2。

    3  讨论

    恶性肿瘤的本质在于细胞周期调节失控，细胞分化受阻从而导致细胞过度增殖。参与细胞周期调控的分子包括周期素、周期依赖性激酶和周期依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）。p21WAF1（wide-type P53-activated factor1，WAF1）是最早发现并克隆的细胞周期依赖性激酶抑制蛋白，具有广泛的激酶抑制活性，几乎可与每一个cyclin-CDK复合物结合，抑制各种cyclin-CDK复合物[5]。目前研究发现p21WAF1与多种肿瘤的发生、发展和预后有关，如胰腺癌、乳腺癌、结肠癌等。
本实验发现，胃癌组织中p21WAF1的表达值明显低于其癌旁组织和正常黏膜组织；p21WAF1表达水平在不同浸润深度及有/无淋巴结转移的胃癌组织中差异有显著性(P<0.05)。苏琦等[6]对108例胃癌标本、20例正常胃黏膜和40例不典型增生胃标本进行p21WAF1蛋白分析，发现在正常胃黏膜、不典型增生、胃癌中p21WAF1表达率分别为100%、92.5%、39.8%，此研究结果与本实验相似。以往研究发现，p21WAF1基因表达的失活与进展期胃癌的浸润深度及淋巴结、血道转移密切相关[7]。Ogawa等[8]发现p21WAF1阴性表达患者中79.8%发现淋巴结转移，88.2%有肝转移，88.6%有腹膜播散，并且其表达与胃癌的组织学类型有关。以上结果均显示了p21WAF1低表达与胃癌的侵袭力、转移关系密切，对预后判断有重要意义。

    此次研究中将分化较好和分化较差的胃癌组织进行p21WAF1表达水平的比较，发现两者之间差异没有显著性。实验的预期结果是分化较好的胃癌组织其p21WAF1表达水平高于分化较差的胃癌组织，以进一步证实p21WAF1低表达与胃癌恶性生物学行为的关系。但实验结果未发现有明显差异，其原因考虑可能与下列因素有关：①本实验分化较好的样本例数相对较少，会对实验结果的分析产生一定的影响。②是否与肿瘤细胞处于不同的细胞周期有关：如果细胞在G1期发生DNA损伤，那么p21WAF1产生就会增多，从而抑制cyclin-CDK的活性，阻止细胞进入S期。③可能与p21WAF1基因多态性及阳性表达与肿瘤的关系因不同类型肿瘤而异。因此，后续实验将通过扩大样本例数及利用流式细胞仪检测细胞周期进一步加以探索。

    许多研究已证实了组蛋白高/低乙酰化在肿瘤发生中起着重要的作用。细胞中不同基因的转录调节对染色质组蛋白乙酰化的程度有不同的敏感性，其中一些调节细胞周期和凋亡的基因对染色质组蛋白乙酰化高度敏感。本实验发现胃癌组织中p21WAF1基因的表达降低至少部分归因于组蛋白乙酰化水平的低下。以往研究也证实了组蛋白脱乙酰化是胃癌细胞系中p21WAF1基因表达失活的主要机制[10，11]。以往研究也发现丁酸盐和曲古抑菌素A(Trichostatin A，TSA)通过抑制脱乙酰化、增强乙酰化水平而显著上调该基因的转录[12-14]。这些研究结果同样说明癌细胞中p21WAF1基因表达受乙酰化调控，影响其细胞生长。

    p21WAF1基因多态性及阳性表达与多种肿瘤生物学行为有关，有关研究表明p21WAF1基因能诱导胃癌细胞的凋亡，可以逆转肿瘤细胞的恶性表型，为今后胃癌的基因治疗提供了实验依据。越来越多的证据表明，在组蛋白乙酰化的失衡与癌症发生之间存在着密切的联系，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors, HDACIs)会使染色质组蛋白乙酰化水平提高[15,16]，因此导致特定基因表达激活，相应地导致细胞的末端分化或肿瘤细胞凋亡。初步的临床研究表明，人类可以安全的通过抑制HDAC的活性来获得组蛋白高乙酰化水平，因此HDACIs已成为目前肿瘤化疗药物研发领域新的热门靶标[17]。

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