摘要:
目的 探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)在肝细胞癌(HCC)中的表达及意义。 
方法  应用免疫组织化学SP法,对石蜡包埋的50例HCC组织(HCC组)和10例正常肝组织(对照组)标本检测LMP1的表达。 
结果  (1)LMP1阳性表达率HCC癌组织(38%)和癌旁肝硬化组织(38.9%)均高于癌旁非肝硬化组织和正常对照组(均为0,P<0.05);(2)HCC癌组织中LMP1阳性表达率在Ⅲ~Ⅳ(51.7%)高于Ⅰ~Ⅱ期(19.0%,P<0.05),有门静脉癌栓形成(50%)高于无门静脉癌栓形成(16.7%,P<0.05)。  结论  EB病毒LMP1与HCC病期进展及有无门静脉癌栓形成密切相关,可作为估计HCC患者预后的参考指标。

关键词:  癌,肝细胞; 膜蛋白质类; 免疫细胞化学

EB病毒(EBV)已被证实是鼻咽癌和Burkitt淋巴瘤明确的致瘤病因,与肺癌、胃癌、乳腺癌的关系也很密切。EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)具有细胞恶性转化的功能,已被认为是一种致瘤蛋白。笔者采用免疫组织化学法检测原发性肝细胞癌(HCC)中LMP1的表达,结合HCC临床病理特征,探讨EBV LMP1与HCC可能存在的关系。

1  材料与方法

1.1  一般资料  收集福建医科大学病理学系及附属第一医院病理科19962003年HCC患者50例病理资料(HCC组),男性33例,女性17例,中位年龄53岁(30~73岁)。50例均带有癌旁肝组织,其中36例癌旁肝组织见肝硬化,14例癌旁未见肝硬化;合并镜下门静脉癌栓者32例(64%)。临床TNM分期按UICC标准,Ⅰ期2例,Ⅱ期19例,Ⅲ期25例,Ⅳ期4例。HCC分级按WHO标准,高分化7例,中分化18例,低分化25例。各病例临床、病理资料完整。收集尸检的正常肝组织10例作为对照组。

1.2  方法  所有标本均经甲醛固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。一抗鼠抗人LMP1单克隆抗体(丹麦Dako公司)。工作浓度1∶50、超敏SP(鼠)试剂盒与液体DAB酶底物试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)。石蜡切片经脱蜡水化后,滴加一抗前行抗原修复,用高压法及H2O2甲醇去除内源性生物素。常规SP法(按试剂盒说明书步骤),DAB显色,苏木精对比染色。以已知阳性的鼻咽癌组织切片作阳性对照,以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3  结果判定  按半定量方法判定其表达强度,阳性强度:无着色为0,淡黄色1,棕黄色2,棕褐色3;阳性细胞数(面积):无着色为0,着色面积<1/3为1,1/3~2/3为2,>2/3为3,两项结果相加≥3为阳性。

1.4  统计学处理  采用SPSS 10.0卡方检验，P<0.05为差别有统计学意义。

2  结果

2.1  LMP1蛋白在HCC癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织中的表达强度及分布方式  LMP1阳性定位于细胞质中。HCC癌组织阳性癌细胞表达强度中等或稍弱,呈灶性或片块分布(图1),部分在癌巢边缘呈强阳性表达,表达阳性的癌组织间质中淋巴细胞多见灶性表达。HCC癌旁肝组织肝硬化区域表达呈弥漫或片块分布,非肝硬化区域未见阳性表达。正常肝组织未见阳性表达。

阳性信号位于肿瘤细胞质内,呈棕黄色颗粒状.

图1  肝细胞癌癌组织潜伏膜蛋白1免疫组织化学表达(×200)（略）

Fig 1  The expression of LMP1 in HCC with immunohistochemistry (×200)

2.2  LMP1蛋白在HCC癌组织、癌旁肝组织、正常肝组织中的表达阳性率  LMP1蛋白在HCC癌组织和癌旁肝硬化组织中的表达阳性率高于癌旁非肝硬化组织和正常对照组(P<0.05),癌旁肝硬化组织与癌区肝组织表达阳性率无差异(P>0.05,表1)。

表1  潜伏膜蛋白1在肝细胞癌癌组织、癌旁肝组织及正常肝组织的表达（略）

Tab 1  The positive expression rate of LMP1 in HCC,pericarcinomatous hepatic cirrhosis and normal liver tissues

表中数据为例数.  LMP1:EB病毒潜伏膜蛋白1; HCC:原发性肝细胞癌.  与对照组比较,☆:P<0.05; 与癌旁非肝硬化比较,#:P<0.05.

2.3  HCC癌组织LMP1蛋白的表达与临床病理特征的关系  LMP1蛋白的表达与HCC患者性别、年龄以及肿瘤组织分化程度无明显关系,但与临床分期和有无门静脉癌栓形成密切相关(P<0.05,表2)。

表2  肝细胞癌癌组织潜伏膜蛋白1的表达与临床病理特征的关系（略）

Tab 2  The relationship between the expression of LMP1 and clinical pathological features

表中数据(除阳性率)为例数.  阳性率组内比较，☆:P<0.05.

3  讨论

3.1  EBV及其LMP1与肿瘤的关系  EBV是一种DNA疱疹病毒,随着研究的不断深入,人们发现它不仅与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤的发生有关,而且在其他多种肿瘤如胃癌、肺癌、乳腺癌等的发生发展过程中也起了重要作用。EBV编码的LMP1被证实具有促进细胞恶性转化和增殖、抑制细胞分化和凋亡、增强瘤细胞侵袭能力等作用,它既可作为肿瘤中EBV潜伏感染的一个客观指标,又可能是介导EBV致瘤的一个关键步骤。

3.2  对EBV在HCC中所起作用存在不同看法  EBV对HCC发生、发展有无作用,目前说法不一。欧美学者认为EBV与肝癌的发生无关[12];而日本的Sugawara等则认为EBV与丙肝病毒感染的肝细胞癌有关[3],我国学者研究认为我国HCC与EBV感染有一定关系[45],学者们得出的结论不同可能与地区病毒类型的不同和种族差异有关。

3.3  LMP1在HCC中的表达及对感染途径的推测  本研究显示,在肝癌前病变(癌旁肝硬化)和癌组织中LMP1阳性率(分别为38.0%和38.9%)高于对照组正常肝组织及癌旁非肝硬化组织(均为0),差别具有统计学意义,而癌细胞与癌旁肝硬化细胞何者先潜伏感染EBV,亦或两者不分先后、伴随感染尚待研究,但说明了EBV LMP1与HCC有一定关系。目前的报道普遍认为,B淋巴细胞通过其表面的CD21受体而被EBV感染,体内上皮细胞并不表达CD21。肝癌细胞感染EBV的途径如何?是否通过表达CD21以外的亲EBV受体而被感染,或通过与相邻受感染B淋巴细胞的直接接触而被感染[6]?这些问题均有待深入研究。本研究发现,阳性病例间质中多有丰富的淋巴细胞浸润并见灶性表达,癌巢边缘表达强阳性的病例,其相邻间质中淋巴细胞表达亦呈强阳性,似乎也支持以上假设,体现了肝癌组织中浸润的淋巴细胞的重要性。

3.4  LMP1对判断预后的意义  本实验结合患者的临床病理特征发现肝细胞癌组织中LMP1蛋白的表达与临床分期的早晚、有无门静脉癌栓形成有相关性。Ⅲ~Ⅳ期较Ⅰ~Ⅱ期、有门静脉癌栓形成较无门静脉癌栓形成LMP1表达阳性率高(P<0.05)。而临床分期和门静脉癌栓有无形成是判断预后的重要指标,因此可以认为癌组织中LMP1蛋白的表达阳性率高低与患者的预后密切相关。阳性率越高,可能意味着预后越差。LMP1可作为判断HCC患者预后的一个参考指标。这与一些研究认为“LMP1片段有直接免疫抑制特性,可介导对肿瘤浸润淋巴细胞的免疫抑制效应,阳性者预后差”的论断相符合,而与有些学者“LMP1阳性的肿瘤细胞仍更有效地刺激局部免疫反应,预后好,而阴性细胞因免疫原性低、逃避了免疫监视而预后差”的结论存在差异。

参考文献：

[1]  Chu P G,Chen Y Y,Chen W,et al. No direct role for EpsteinBarr virus in American hepatocellular carcinoma[J]. Am J Pathol, 2001,159(4):12871292.

[2]  Junying J,Herrmann K,Davies G,et al. Absence of EpsteinBarr virus DNA in the tumor cells of European hepatocellular carcinoma[J]. Virology, 2003,306(2):236243.

[3]  Sugawara Y,Makuuchi M,Takada K. Detection of EpsteinBarr virus DNA in hepatocellular carcinoma tissues from hepatitis Cpositive patients[J]. Scand J Gastroenterol, 2000,35(9):981984.

[4]  郝瑞安,胡志坤,陈杨东,等. 原位PCR法定位检测原发性肝细胞性肝癌组织中EB病毒核酸的临床意义[J]. 四川肿瘤防治, 2004,17(4):223224.

[5]  Li W,Wu B A,Zeng Y M,et al. EpsteinBarr virus in hepatocellular carcinogenesis[J]. World J Gastroenterol, 2004,10(23):34093413.

[6]  江培洲,沈新明,吕丽春,等. 细胞间接触是EB病毒自发感染人类上皮细胞的有效途径[J]. 中国病毒学, 2004,19(1):15.