【摘要】 目的 研究三氧化二砷（as 2 o 3 ）对大鼠体内实验性肝癌的治疗作用及其作用机制。方法 选择健康成年封闭群雄性sd大鼠（2个月龄），以含0.05%2-乙酰氨基芴（2-faa）进行喂饲制备大鼠肝癌模型。治疗组以两种浓度的as 2 o 3 溶液与复方苦参分别注射于大鼠腹腔，每日1次，2周后改为每周2次，总给药时间为4周;同时设生理盐水对照组（ns）。治疗4周末处死大鼠，获取肝脏组织和血清;称肝湿重;记录肝表面肿瘤结节分布情况;肝肿瘤组织he染色后在光镜下观察肝脏组织形态学变化;流式细胞仪检测肿瘤细胞动力学变化;并测定血清丙氨酸氨基转移酶（alt）、谷丙转氨酶（ast）及总胆红素（tbi）和结合胆红素（dbi）水平。结果 as 2 o 3 治疗组，肝肿瘤结节明显少于生理盐水对照组，尤以中剂量as 2 o 3 治疗组表现最为显著（p<0.01）。流式细胞仪检测显示as 2 o 3 引起大鼠体内肝癌细胞凋亡率上升（p<0.05），中等剂量as 2 o 3 治疗组（1mg/kg）上升明显（p<0.001）;s期百分率明显下降（p<0.001）。中剂量as 2 o 3 引起g 0 /g 1 期细胞数明显增多，且大量发生凋亡，癌细胞坏死少见，细胞增殖指数（pi）明显下降（p<0.05）;小剂量as 2 o 3 引起凋亡率上升，但强度明显减弱。复方苦参和生理盐水对照组上述各项指标相比差异无显著性（p>0.05）。各治疗组的血清ast活性明显低于生理盐水对照组（p<0.05），但各组之间差异无显著性（p>0.05）;血清alt、tbi及dbi水平各组之间以及与生理盐水对照组差异均无显著性（p>0.05）。结论 as 2 o 3 对大鼠肝细胞肝癌生长具有明显抑制作用，并且对肝功能又无明显毒副作用。作用机制可能与抑制肿瘤细胞dna合成，减少细胞分裂，增加静止期细胞，从而诱发大鼠肝癌细胞凋亡有关。

关键词 三氧化二砷 凋亡 肝细胞肝癌 实验性鼠 2-乙酰氨基芴 

a study on the effect of arsenic trioxide on  experimental rat hepatocellular carcinoma  

tan bing，huang jiefei
    
the affiliated hospital of nantong medical college，jiangsu226001.
【abstract】 objective to studay the anti-hepatoma efficiency of the treatment of experimental rat hepatoˉcellular carcinoma（hcc）induced by2-acetamidofluorene（2-faa）with arsenic trioxide（as 2 o 3 ）and to elucidate the possible mechanisms.methods sd rats（2months old）had been fed with2-faa for8weeks to induce hcc，then treated with as 2 o 3 and matrine.on day29，we weighed the liver and counted liver tumors.the histological changes in liver tissue were observed under microscope，and the cellular dynamic parameters were studied by flow cyˉtometry.the levels of serum ast，alt，tbi and dbi were also investigated.results the number of liver tumors deˉcreased significantly in groups treated with as 2 o 3 ，especially in middle-dose（1mg/kg）group（p<0.01）.treatment with as 2 o 3 cause hcc cell death via apoptostic，the necrosis was seldom and apoptosis was common when the dose was appropriate（1mg/kg）.proliferation index（pi）decreased sharply in middle-dose（1mg/kg）group（p<0.01），but not in another（0.2mg/kg）group（p>0.05）.however，sphase fraction（spf）decreased dramatically in the two groups，it reached the top only when the dose（1mg/kg）was appropriciate（p<0.01），and it was obviously accompaˉnied with accumulation of cells in g 0 /g 1 （g 0/g 1 restriction）.comparing with normal saline group，administration of as 2 o 3 or matrine lowered the levels of ast in serum（p<0.05），but has no effect on the amount of serum ast，tbi and dbi（p>0.05）.conclusion arsenic trioxide inhibited growth of experimental hepatocellular carcinoma in rats induced by2-acetamidofluorene，but as 2 o 3 had no obvious effect on the normal hepatic cells.the mechanisms may involved in decreasing cell division，accumulation cells in g 0 /g 1 phrase，inducing apoptosis of tumer cells.
　key words arsenic trioxide apoptosis hepatocellular carcinoma experimental rat 2-acetamidofluorene  

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，hcc）是消化系统常见的肿瘤，其恶性程度高，预后差。据我国卫生部统计，肝癌在我国已上升为第二位癌症杀手，在城市仅次于肺癌，在农村仅次于胃癌，所以肝癌的防治很重要 ［1，2］  。近年来，对于不能手术切除的肝细胞肝癌的药物治疗的有关报道很多，如应用他莫西芬［3］  、flutamide ［4］  、碘化油（lipidol）栓塞 ［5～7］  等，但治疗效果都不太理想。

近年来，砷剂（主要成分三氧化二砷，as 2 o 3 ）治疗白血病取得明显疗效，并已证实砷剂可通过诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗的目的 ［8～11］  。最近的研究显示，as 2 o 3 除了对血液系统肿瘤有诱导凋亡效应，尚可诱导某些实体瘤细胞如神经母细胞瘤细胞 ［12］  与食管瘤细胞 ［13］  凋亡。此外，as 2 o 3 对肝癌抗肿瘤作用的研究也相继开展。有报道砷剂可诱导人肝细胞株凋亡，抑制肝癌细胞增殖 ［14，15］  。
   
as 2 o 3 是一种剧毒物，又称砒霜。张惆等 ［16］  实验表明大剂量as 2 o 3 （5ml/kg）致肝癌细胞凋亡数量增多，但同时出现大量坏死，引发炎症反应。as 2 o 3 对体内肝癌的作用尚未报道，为了进一步研究其的抗肿瘤效应及其机制，以期为临床上使用as 2 o 3 治疗肝细胞肝癌的可行性提供理论依据，我们的研究设计用as 2 o 3 治疗实验性肝癌大鼠，采用流式细胞仪（fcm）观察肿瘤细胞周期的相对时相分布、细胞增殖指数（pi）及凋亡率;观察肝脏表面肿瘤数目及组织形态学改变（肿瘤生长情况及细胞凋亡形态学改变）、大鼠体重及血清反应肝功能损害的酶学变化，研究as 2 o 3 及复方苦参对体内肝癌的治疗作用及其作用机制。

1 材料与方法
   
1.1 建立大鼠肝癌模型 选择雄性封闭群sd大鼠（2月龄）70只，体重140～180g（由南通医学院实验动物中心提供），喂饲的颗粒饲料中拌入浓度为0.05%（w/w）的致癌剂2-乙酰氨基芴（2-faa，购自美国sigma公司），所有sd大鼠均以恒环境饲养。在致癌过程中，第3～5周大鼠死亡较多，其中第4周开始死亡的大鼠尸体解剖均发现肝脏表面有肉眼可见的白色结节，病理证实呈明显的异型性改变，并且随造模时间的延长结节数量及大小亦呈增加趋势。第8周末70只大鼠仅34只存活。第9周开始所有大鼠均喂饲正常颗粒饲料。
   
1.2 动物分组 将上述34只致癌大鼠按体重大小均衡地分为4大组:第一组用as 2 o 3 （亚砷酸注射液，哈尔滨伊达药业有限公司生产）治疗，分为中剂量as 2 o 3 （1mg/kg）、小剂量as 2 o 3 （0.2mg/kg）2小组，按1∶4与生理盐水的体积稀释后腹腔注射，每天1次，2周后改为每周2次;第二组应用复方苦参（山西金晶药业有限公司惠赠）治疗，剂量为4.2g/kg体重，给药途径和给药时间同上;第三组以生理盐水1.5ml/kg体重，治疗方法同上。治疗开始后每日观察大鼠用药后情况及反应、每周称体重并按体重变化调整用药剂量。
   
as 2 o 3 治疗剂量的选择以as 2 o 3 治疗人白血病的剂量为依据（10ml/d），按人与大鼠间体表面积折算的等效剂量等值表 ［17］  计算得出，以此为中等剂量（1mg/kg），并同时得出小剂量（0.2mg/kg）。复方苦参剂量的选择根据药理实验小鼠化疗剂量（6.4g/kg），按小鼠与大鼠体表面积折算的等效剂量比 ［17］值表计算得出。
   
1.3 大鼠肝脏及血清标本的获取 治疗满4周时，分别处死大鼠。
（1）打开胸腹腔，暴露心脏后即用注射器抽取心脏血4～5ml，置试管中待血液凝固，分离血清并置于-20℃冰箱中冻存备用。
（2）完整剪下肝脏，生理盐水漂洗后称取肝湿重。
（3）观察肝脏表面情况，并记录表面肿瘤结节分布、大小和数目。
（4）尽量手术获取肝肿瘤结节，并沿肝瘤结节中心分为两份，其中一份新鲜标本参照文献 ［24］  制成单细胞悬液，用于流式细胞仪检测，另一份固定于10%中性甲醛中，常规he染色后光镜下观察肝脏组织学变化。
1.4 流式细胞术观察肿瘤细胞周期的相对时相分布、细胞增殖指数（pi）及凋亡率等
   
1.4.1 细胞悬液的制备 取大鼠新鲜肝脏表面的肿瘤结节组织约0.2g，pbs清洗2遍，用机械法剪碎组织，经300目尼龙网过滤成细胞悬液。

1.4.2 细胞固定 取细胞悬液［（1～2）×10 6 ml］1ml，离心（1000rpm×5min）弃上清，5ml pbs轻洗、离心、弃上清后，加入预冷70%（v/v）乙醇溶液2ml，然后置于-20℃冰箱中固定12～18h以上。
   
1.4.3 细胞染色 固定好的细胞悬液离心（1000rpm×5min）弃上清，用5ml pbs轻洗、离心、弃上清2次。随后加入0.01%的rnase溶液（becton dickinson公司）200μl，混匀，放置于4℃冰箱中30min。最后加入50μg/ml碘化丙锭溶液（becton dickinson公司）200μl放在4℃冰箱中避光染色10min。染色结束后，1h之内上流式细胞仪检测，上机前用300目尼龙网再次过滤1次。
   
1.4.4 流式细胞仪检测 采用becton dickinson公司的facs calibur型流式细胞仪。激光发源为5w氩离子激光器，激光功率200mw，激发波长为488nm。戊二醛固定鸡血红细胞调节仪器的变异系数（cv）<4%。应用荧光微球校正颜色补偿调节器的灵敏度。取样1×10 4 个细胞，数据储存于计算机中。
   
1.4.5 结果分析 在becton dickinson公司的流式细胞仪上，采用cell quest软件进行样本获取，modifit软件进行分析。取1份正常外周血淋巴细胞（npbl）和1份正常sd大鼠肝脏组织细胞作为对照，一来确定碘化丙锭染色效果，二来确定二倍体细胞（g 0 /g 1 期细胞）所在的道数（channel）。以鸡血的g 0 /g 1 峰作为内标准，分别测定待分析细胞的g 0 /g 1 和g 2 /m峰，计算出dna含量，再根据细胞dna含量组方图，由程序化的计算机分别拟合出各细胞周期分布比率。g 0 /g 1 峰前的亚二倍体峰为凋亡峰。增殖指数（proliferative index，pi）等于s期和g 2 /m期细胞总数的比率。s期百分率（s-phase fraction，spf）等于s期细胞数占细胞总数的比率。
   
1.5 血清酶学检查
   
1.5.1 血清丙氨酸氨基转移酶（alt）活性测定 采用2，4二硝基苯腙显色法（赖式法）检测。
   
1.5.2 血清谷丙转氨酶（ast）活性测定 采用比色法检测。
   
1.5.3 血清总胆红素和结合胆红素测定 采用卫生部临检中心推荐方法（j-g法）。
   
1.6 病理组织学检查 取10%甲醛液前固定后的肝组织，再以15%酒精甲醛后固定，经无水酒精脱水、浸蜡、包埋、机器切片4μm、烘干、二甲苯脱蜡、蒸馏水洗涤后进行常规he染色。
   
光镜标本在光镜下观察肝脏组织学变化。观察肝组织内肿瘤形成情况及细胞凋亡形态学变化，并用olympus bh2bhs-313显微摄影显微镜进行摄像。
   
1.7 统计学分析 实验数据用ˉx±s表示，采用exell和stata7.0统计分析软件进行数据处理，根据具体数据采用相应的分析方法，如采用单因素方差分析等。

2 结果
   
2.1 用药过程中的一般情况 在中剂量三氧化二砷治疗的第1周，有个别sd鼠有一过性呼吸急促、心跳加快、四肢末梢紫绀，约0.5～1天后自行恢复。另外各治疗组及对照组腹腔注射的局部出现皮肤硬结，每天更换腹腔注射部位可避免皮肤硬结的形成。
   
在4周的治疗过程中，各治疗组与生理盐水对照组相比，体重增加值、肝湿重/体重比的差异差异均无显著性（p >0.05）（见表1）。

表1 体重及肝湿重变化 （略）

2.2 形态学改变
   
2.2.1 大体变化 致癌大鼠的肝脏与正常大鼠相比较，颜色偏灰白，肝脏质地变硬，切面结节内偶有出血坏死;体积和重量均明显增加，肝表面呈多发结节样改变，大小不一，直径多在1～6mm之间，其中生理盐水对照组有1个结节直径达9mm;部分肝叶上结节呈弥漫分布，生理盐水对照组中表面弥漫分布的结节多为粗颗粒状，且累及叶数多;相比而言，as 2 o 3 治疗组中结节弥漫分布于肝叶的数量少，范围小，且多呈细颗粒状;其他各组界于二者之间（见表2）。

表2 肝脏表面肿瘤结节数量的变化（略）

在治疗4周末，a组有5只大鼠肝脏表面未找到肉眼可见的结节，而同期生理盐水对照组肝脏表面均见有结节分布，可见弥漫分布于肝叶的结节，仅1只大鼠肝结节呈散在分布（见图1、图2）。
   
各治疗组治疗4周末，a组大鼠肝表面肿瘤结节数及弥漫性分布肝叶数与b组相比差异具有显著性（p<0.05），b组与c组相比差异无显著性（p>0.05），a组与d组相比差异具有非常显著性（p<0.01）。

2.2.2 光镜检查 各组2-faa致癌的sd大鼠肝脏组织显微镜下可见肝细胞变性，卵圆细胞增生，汇管区炎症细胞浸润，结缔组织增生，有大小不等的再生结节和癌巢结节形成。其中生理盐水对照组有较广泛炎症细胞浸润和假小叶形成，肝细胞癌变形成较多的癌巢结节。a组治疗组病理改变明显轻，汇管区炎症细胞浸润少，再生结节相对较多，部分细胞出现异型性改变，但癌巢结节少或偶见（见图3）。治疗组中部分肝癌细胞呈现凋亡特征，凋亡细胞与周围细胞分离，呈圆形或卵圆形，胞膜完整，核染色质固缩、边集或碎裂，形成大小不等的胞内小体，胞浆皱缩，嗜酸性增加，周围无炎性细胞浸润（见图4）。其他各治疗组病理改变界于二者之间。
   
2.3 细胞动力学检测结果 肿瘤细胞周期相对时相分布情况:治疗4周末，与d组相比，a组g 0 /g 1 期细胞百分率显著上升（p<0.01），但两组相比差异无显著性。b、c各组与d组比较差异无显著性（p>0.05），a和b组、b和c组分别两两相比差异无显著性（p>0.05）;a、b组s期细胞百分率与d组相比均显著下降（p<0.001），c组差异无显著性（p>0.05），a组与c组相比差异有显著性（p<0.001），a组与b组相比差异有显著性（p<0.01），b和c组之间差异无显著性（p>0.05）;a组g 2 /m期细胞百分率与d组相比显著下降（p<0.05），其他各组与生理盐水组相比差异无显著性（p>0.05），a组与其它各组之间差异也无显著性（p>0.05）（见表3，图5、图6）。
   
治疗4周末，a组pi值下降最明显（p<0.001），a与c组相比差异有显著性（p<0.01），a和b组、b和c组分别比较差异无显著性（p>0.05）。

表3 各组间细胞周期时相分布及增殖指数的比较（略）

注:与d组相比， ˇˇ p<0.01;与c组相比， △△ p<0.01;与b组相比， ▲▲ p<0.01 

经统计学处理，与生理盐水组相比，治疗4周后a组凋亡率升高最明显（p<0.01），b、c组差异无显著性（p>0.05）。
   
2.4 肝功能改变情况 在4周的治疗过程中，各治疗组与 生理盐水对照组相比，alt、tbi、dbi的差异均无显著性（p>0.05），ast均低于生理盐水对照组（p<0.05），ast、alt、tbi、dbi在各治疗组差异均无显著性（p>0.05）（见表4）。

表4 ast、alt、tbi、dbi的变化（略）
 
注:与d组相比， ˇ p<0.05
   
3 讨论

对于不能手术切除的肝细胞肝癌的药物治疗的有关报道很多，治疗效果都不太理想，常用的化学药物治疗肝癌时，由于严重的毒副作用，患者耐受性差，疗效不佳。目前认为肿瘤的发生和发展与细胞的异常增殖有关，同时也与细胞凋亡异常有关 ［18，19］  。从细胞凋亡的角度探讨肿瘤的发生和发展规律，将有可能阐明肿瘤的发病机制，并为肿瘤的治疗开辟新的途径 ［20］  。
   
as 2 o 3 对hcc的抗肿瘤机制尚不明确。
一般认为其主要作用途径包括:
（1）诱导肿瘤细胞凋亡;
（2）抑制肿瘤转移;
（3）影响肝癌细胞免疫功能;
（4）通过抑制vegf合成间接抗肿瘤血管形成;
（5）与化疗药联合的增效作用。本实验以原发性肝细胞肝癌模型为基础，观察砷剂的抗肿瘤作用。本实验表明，as 2 o 3 对大鼠体内肝癌细胞有诱导凋亡的作用。不同剂量as 2 o 3 诱导肝癌细胞凋亡的程度不同，存在最适剂量问题。有学者认为 ［16］  ，as 2 o 3 剂量过高时，2种细胞死亡机制同时发生作用，虽在一定程度上诱导癌细胞凋亡，但同时可致细胞毒杀伤作用，引起癌细胞坏死，引发炎症反应，同时还可能对正常肝细胞产生细胞毒杀伤作用;剂量过小，细胞毒杀伤作用较弱，虽也可诱导肝癌细胞大量凋亡，但强度低，达不到治疗的目的，剂量适中，即可诱导肝癌细胞大量凋亡，又不会产生明显的细胞毒杀伤作用，本实验对此观点作了进一步证明。

pi及spf通常反应肿瘤细胞增殖水平，本研究发现，as 2 o 3 作用下，肿瘤细胞周期时相分布呈现出增殖受抑现象，即spf、g 2 /m期及pi值均减低（p<0.05），g 0 /g 1 期升高，出现g 0 /g 1 期阻滞现象，原因可能:（1）as 2 o 3 在适当浓度下抑制细胞dna合成，造成细胞从g 1 期向s期的发展受阻，g 0 /g 1 期细胞堆积或停滞;（2）恶性肿瘤细胞群体中，处于增殖周期的瘤细胞，即s期和g 2 /m期细胞，其分裂增殖能力很强，但同时对理化药物反应也最敏感，或被直接杀伤，表现为形态学死亡，或增殖活性受抑制。pi值下降与s期或g2/m期或两者细胞数均下降有关，我们发现，砷剂作用下s期细胞明显减少。s期为dna合成期，遗传物质倍增主要发生在此期。中剂量砷剂治疗组pi值下降与s期细胞减少有直接关系:小剂量as 2 o 3 治疗组pi值变化虽不明显，但spf值也下降，说明这组相对低剂量as 2 o 3 同样可显著抑制癌细胞dna的合成，只是作用强度不如前者。由此可见，as 2 o 3 可通过抗肿瘤细胞增殖和促进凋亡发生2条 途径来发挥其抑癌作用。至于as 2 o 3 诱导肝癌细胞凋亡的相关基因变化尚有待进一步研究。
   
细胞周期与肿瘤的关系密切。不同周期时相细胞对外界各种因素包括药物和射线等敏感性不同，是化疗和放疗等抗癌的理论依据 ［21］  。实验结果表明，as 2 o 3 突出的特点是中剂量砷剂治疗组出现g 2 /m期阻滞现象。已研究证实，砷剂作用于人肝癌 ［14］  、胃癌 ［22］  及胰腺癌 ［23］  等癌细胞株均可出现g2/m期阻滞现象;而在人乳腺癌细胞株，则出现随砷剂剂量不同细胞周期阻滞时相不同的现象 ［24］  。本实验表明，中剂量as 2 o 3 治疗组作用于大鼠肝癌细胞出现g 0 /g 1 期停滞现象，与以前的研究结果似乎不相符合，我们推测，不同剂量的as 2 o 3 对肝癌细胞周期产生不同的影响，周期阻滞后的结局也各不相同。
   
本实验中as 2 o 3 对大鼠形态学上改变亦能用其在细胞动力学方面的作用得到合理解释。大体观察发现as 2 o 3 治疗组肝脏表面平均结节数及平均弥漫分布肝叶数少于生理盐水对照组，以中剂量as 2 o 3 治疗组表现为著。
   
本实验发现，各治疗组的肝癌大鼠血清ast活性低于生理盐水对照组，各组肝癌大鼠血清alt活性差异无显著性，说明as 2 o 3 和复方苦参对肝细胞无明显毒副作用。
   
临床肿瘤化疗中，给药方法是很重要的一个环节。本实验结果显示，砷剂连续腹腔注射，继以间断注射，凋亡率均显著升高;既能取得很好的疗效，又可减少全身毒副作用。总之，人们对as 2 o 3 的抗肿瘤作用机制的认识已进入一个崭新的阶段。as 2 o 3 因其对肝癌细胞增殖的有效抑制以及诱导凋亡的作用，加之中剂量又无明显的毒副作用，故有望成为治疗肝癌的一个依从性较好的有效药物，这为肝癌的综合治疗有开辟了一个新的领域。

参考文献