【摘要】　目的　研究端粒酶作为原发性肝细胞癌(HCC)肿瘤标志物的可能性。方法　采用TRAP方法检测了33例原发性肝细胞癌及其33例癌旁组织、4例肝转移癌及其4例癌旁组织、6例肝良性肿瘤和6例正常肝组织中的端粒酶活性。结果　33例原发性肝细胞癌组织中，有30例端粒酶表达阳性，其阳性率为90.9%。33例癌旁组织中，有9例端粒酶表达阳性，其阳性率为27.3%。4例肝转移癌端粒酶活性均阳性，4例癌旁组织中，2例端粒酶表达阳性。6例肝良性肿瘤中，仅1例端粒酶表达阳性。6例正常肝组织端粒酶表达均阴性。肝癌组织端粒酶表达与肿瘤临床病理特征无关。结论　肝癌组织中普遍存在端粒酶活性表达，而良性和正常肝组织中端粒酶活性较少表达。端粒酶有可能成为诊断原发性肝细胞癌的肿瘤标志物。

　　 Telomerase activity in liver cancer and the adjacent tissue　Fu jianmin, Zhang Wei, Jin Shunqian, et al. Cancer Institute (Hospital), Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021

　　【Abstract 】　Objective　To investigate the possibility of using telomerase as a tumor marker for human primary hepatocellular carcinomas(HCC). Methods　Human liver specimens, comprising 33 HCC and adjacent peritumoral tissues, 4 hepatic metastases and the adjacent peritumoral tissues, 6 benign liver lesions and 6 normal liver tissues, were examined for telomerase activity by TRAP assay based on pCR.Results　Thirty of 33 HCC and 9 of 33 adjacent tissue specimens were positive for telomerase activity with a positive rate of 90.9% and 27.3%, respectively. Four hepatic metastatic cancer and 2 adjacent tissues were positive. Telomerase activity was negative in 6 nomal liver tissues and 5 of 6 benign liver lesions. There was no correlation between the clinical stage of HCC and their telomerase activity.Conclusion　Positive telomerase activity occurs in the majority of HCC examined. It can be used as a tumor marker in the diagnosis of HCC.

　　【Subject words 】　Liver neoplasms　　Carcinoma，hepatocellular　　Telomerase　　Polymerase chain reaction

　　最新统计结果表明，我国原发性肝癌病死率在所有恶性肿瘤中居第2位［1］。近年来研究发现，端粒酶在人体绝大多数恶性肿瘤组织中被活化，而在人体生殖细胞、某些淋巴细胞和造血干细胞以外的正常组织中无表达，提示端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物，在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。原发性肝细胞癌(HCC)组织中端粒酶检测研究国外已有报道，我们采用以PCR技术为基础的TRAP(telomeric repeat amplification protocol)方法，对HCC及其相应癌旁组织、肝转移癌及其相应癌旁组织、肝良性肿瘤和正常肝组织进行端粒酶活性检测，以探讨端粒酶作为HCC肿瘤标志物的可能性。

材料与方法

　　1.标本来源：全部组织标本(包括33例HCC及其癌旁组织，4例肝转移癌及其癌旁组织，6例肝良性肿瘤和6例正常肝组织)均取自我院1996年10月～1997年10月间手术切除标本，标本均于离体后半小时内采集，剔除坏死出血组织，液氮速冻，后转至-80℃冰箱贮存备用。所有病例均经病理证实。

　　2.端粒酶提取：每例标本取100 mg组织，用液氮速冻后在研钵中研成粉沫，再转至1.5 ml试管中，立即加入预冷的裂解液200 μl［10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)；1 mmol/L MgCl2；1 mmol/L EGTA，5 mmol/L 二巯基乙醇，0.5% CHAPS，10%甘油］，混匀后在0℃裂解30分钟，13 500 r/min 4℃离心30分钟，吸取上清至一新预冷管中，采用BCA试剂盒(Sigma公司产品)进行蛋白质含量测定，放-80℃冰箱冻存。

　　3.端粒酶检测：采用TRAP法检测端粒酶活性［2］，反应体积25 μl，反应体系含20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，1 mmol/L MgCl2，63 mmol/L KCl，0.005% Tween-20， 1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L dNTP, 1 μg T4基因32蛋白，0.1 μg/ml BSA，74 kBq α32P-dCTP，2U Taq酶和0.1 μg TS引物(5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’)加6 μg组织蛋白，混匀后30℃保温30分钟，90℃ 90秒灭活端粒酶，加0.1 μg CX引物(5’-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3’)，混匀后覆盖石蜡油，在PE480 PCR仪上进行31个循环，循环参数为90℃40秒，50℃40秒，72℃50秒，最后于72℃延长10分钟，加入6 μl电泳加样缓冲液，在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，电泳后凝胶与X线胶片置-80℃放射自显影，12小时后显示结果。每次检测以6 μg肺癌细胞系GLC蛋白作为阳性对照，阴性对照在反应液中不加组织提取物。

　　4.统计分析：χ2检验进行统计分析。

结果

　　1.肝组织中端粒酶活性表达：在33例HCC中，有30例端粒酶表达阳性，阳性率90.9%，阳性结果经放射自显影后可见间隔6 bp的梯形带(附图)。33例癌旁组织中，有9例端粒酶阳性，阳性率27.3%。4例肝转移癌(3例大肠癌和1例乳腺癌)组织端粒酶均表达阳性；4例相应癌旁组织中，有2例端粒酶表达阳性，均为多发肝转移。6例肝良

P：肺癌细胞系GLC为阳性对照；L：端粒酶裂解缓冲液为阴性对照；T：原发性肝细胞肝癌组织；N：癌旁组织

　　附图　端粒酶在肝组织标本中的表达

　　性肿瘤中，1例阳性者为肝脏炎性假瘤，5例阴性者为肝海绵状血管瘤。6例正常肝组织均阴性。

　　2.HCC及癌旁组织端粒酶活性表达与临床病理的关系：HCC肿瘤大小、数目、有无包膜、病理分级及HBsAg情况与端粒酶表达无关(附表)，各组内端粒酶活性差异无显著性(P＞0.05)。端粒酶表达阳性的癌旁组织均伴有明显肝硬化，3例伴有2个以上肿瘤。大肝癌、无包膜、多结节、HBsAg阳性的癌旁组织端粒酶表达阳性率高于小肝癌、有包膜、单结节及HBsAg阴性组，其中HCC有无包膜的癌旁组织端粒酶活性差异有显著性(P＜0.05)。

讨论

　　端粒酶是一种核糖核蛋白复合体，是一种专一的逆转录酶，能以自身的RNA为模板从头合成端粒，以补偿细胞分裂时的染色体末端缩短，维持端粒

附表　HCC及癌旁端粒酶活性与临床病理的关系

病理情况	例数	肿瘤组织			癌旁组织
		阳性数	阳性率(%)	P值	阳性数	阳性率(%)	P值
分化
高	8	7	87.5		0	0
中	17	16	94.1		8	47.1
低	8	7	87.5	＞0.05	1	12.5	＞0.05
大小
＜3cm	9	8	88.9		1	11.1
3～5cm	11	10	90.9		3	27.3
＞5cm	13	12	92.3	＞0.05	5	55.5	＞0.05
包膜
+	18	16	88.9		2	11.1
-	15	14	93.3	＞0.05	7	46.7	＜0.05
肝炎病毒
HBsAg(+)	24	22	91.7		8	33.3
HBsAg(-)	9	8	88.9	＞0.05	1	11.1	＞0.05
肿瘤数目
单结节	29	26	89.7		6	20.7
多结节	4	4	100	＞0.05	3	75.0	＞0.05

长度。最近的研究表明，端粒酶的活化在细胞癌变中起重要作用。由于端粒酶的活化，使端粒的长度维持一种动态平衡，细胞得以无限制地增殖下去，导致了肿瘤的发生。端粒酶活性已在人体绝大多数恶性肿瘤中检出，Shay等［3］总结了近两年来文献报道的HCC端粒酶活性研究，其阳性率为86.1%(149/173)，癌旁阳性率为2.0%(1/50)，正常肝组织中未见端粒酶活性。我们检测了33例HCC组织端粒酶活性，阳性率为90.9%，其端粒酶活性与HCC肿瘤大小、数目、有无包膜和分化程度无关，与国外文献报道基本一致。提示端粒酶活化普遍存在于HCC组织中，与HCC病理分期无必然联系，这对于诊断高分化的小肝癌有临床应用价值［4］。

　　本研究中，癌旁组织端粒酶阳性率为27.3%，较国外文献报道为高，可能与本组癌旁组织中结节性肝硬化比例高(29/33)有关，且端粒酶阳性癌旁均为肝硬化，其中部分为失代偿肝硬化，这与国外肝炎和肝硬化研究报道基本相符，提示端粒酶活化在HCC早期癌变过程中起重要作用［5～8］。本组中，大肝癌、多结节、无包膜的癌旁组织端粒酶活性高于小肝癌、单结节、有包膜者，提示癌旁端粒酶活化可能与HCC预后有关。对于癌旁端粒酶阳性患者不能排除潜在肝内转移，应加强随访，严密观察肝内转移情况。本组4例肝转移癌端粒酶表达阳性，可能是肝转移癌均为进展期癌的缘故；2例肝转移癌癌旁端粒酶阳性，且均是多发肝转移。研究结果表明，端粒酶有可能成为判定预后的指标。Hiyama等［9］曾报道端粒酶活化可能对胃癌的预后估计有重要意义。本组病例尚少，有待进一步深入研究。

　　本课题部分受中国医学科学院CMB院校长基金资助

参考文献

　　1　李连第，张思维，鲁风珠，等.中国恶性肿瘤死亡谱及分类构成特征研究.中华肿瘤杂志，1997，5：323-328.

　　2　Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity witrh immortal cells and cancer. Science, 1994, 266:2011-2015.

　　3　Shay JW, Bacchetti S.A survey of telomerase activity in human cancer. Eur J Cancer, 1997, 33:787-791.

　　4　Miura N, Horikawa I, Nashimoto A, et al. Progressive telomerase shortening and reactivation during hepatocellular carcinogenesis. Cancer Genet Cytogenet, 1997, 93:56-63.

　　5　Ide T, Takara H, Nakashio M, et al. Telomerase in hepatocellular carcinogenesis. Hum Cell, 1996, 9:283-286.

　　6　Takara H, Nakanishi T, Kitamoto M, et al. Telomerase activity in human liver tissues; comparison between chronic liver disease and hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1995, 55:2734-2736.

　　7　Kojima H, Yokosuka F, Imazeki F, et al. Telomerase activity and telomere length in hepatocellular carcinoma and chronic liver disease. Gastroenterology, 1997, 112:493-500.

　　8　Nakashio R, Kitamoto M, Takara H, et al. Significance of telomerase activity of small differentiated hepatocellular carcinoma. Int J Cancer, 1997, 74:141-147.

　　9　Hiyama E, Yokoyama T, Tatsumoto N, et al. Telomerase activity in gastric cancer. Cancer Res, 1995, 55:3258-3262.