摘　要　同种异基因白细胞输注（allogeneic leukocyte,ALI）治疗造血系统恶性肿瘤已被越来越多的研究证实为一种有效并有前途的过继免疫治疗手段。本文综述了其应用范围，效应机制、增强其抗肿瘤效应和降低相关毒性的方法。

　　 关键词：同种异基因　白细胞输注　移植物抗造血系统肿瘤

　　自从40多年前人们猜测同种异基因骨髓移植（allo-BMT）具有潜在的移植物抗白血病效应（GVL）以来，大量的动物模型与临床移植已证实了这一现象的存在。尤其是Kolb等（1990～1995年）单用供者白细胞输注（DLI）治疗allo-BMT后的慢性粒细胞白血病（CML）的复发取得完全缓解，开创了同种异基因白细胞输注治疗白血病的先河。随后，人们广泛应用它治疗造血系统肿瘤allo-BMT后的复发和微小残留病变，并将应用范围逐渐扩展到allo-BMT后的非复发并发症和未经骨髓移植预处理患者的过继免疫治疗[1]。目前本领域研究的焦点集中在：①探索异基因白细胞抗肿瘤的效应细胞、靶抗原及其机制；②如何增强其抗肿瘤效应的特异性、强度并减轻毒性作用。

　　1 DLI治疗造血系统肿瘤allo-BMT后的复发与非肿瘤复发并发症

　　北美与欧洲多临床中心用DLI治疗造血系统恶性肿瘤allo-BMT的复发总结如表1、2。

表1 DLI治疗CML患者的allo-BMT后复发的完全缓解率

疾病状态	北美（n=55） 　　%	欧洲（n=75） 　　%
慢性期	76	79
加速期	28	12
总 计	60	72

表2 DLI治疗非CML造血系统恶性肿瘤allo-BMT后复发的完全缓解率

疾病	北美*	欧洲	总计
AML	6/39（15%）	5/17（29%）	11/56（20%）
ALL	2/11（18%）	0/12（0%）	2/23（9%）
MDS	2/5（40%）	1/4（20%）	3/9（33%）
NHL	0/6（0%）	NR	0/6（0%）
MM	2/4（50%）	NR	2/4（50%）

注：AML（急性髓系白血病）；ALL（急性淋巴细胞白血病）；MDS（骨髓增生异常综合征）；NHL（非霍奇金淋巴瘤）；MM（多发性骨髓瘤）*仅指可评估的患者。

　　从上表看出，DLI治疗效果表现出明显的疾病相关性。此外，DLI的受者往往表现出程度不同的毒性并发症：①急、慢性移植物抗宿主病（GVHD）；②全血细胞减少和骨髓再生不良，表现为感染、出血和贫血；③感染，与骨髓再生不良和GVHD治疗的免疫抑制相关[1]。

　　与allo-BMT相比，DLI所致的GVHD通常为轻中度，可能与缺乏allo-BMT前预处理导致的所谓“细胞因子风暴”相关。全血细胞减少持续时间较短[1]。

　　目前有限的资料提示，DLI治疗获得完全缓解者，大部分长期缓解维持时间较短，平均约21个月[1]。

　　总之，DLI治疗造血系统肿瘤allo-BMT后的复发是有效的，并表现出疾病的相关性；同时往往合并一定的毒性并发症，严重者导致死亡；其长期缓解维持时间较短。这需要人们在未来的研究中，除探索增强DLI的GVL效应，减轻其毒性作用外，尚应提出维持长期缓解的有效方案。

　　既然DLI能恢复移植后复发的GVL效应，人们猜测它同样能恢复细胞介导的免疫功能缺陷，用于治疗移植后免疫功能低下引起的感染等并发症。随后，多中心研究者成功地运用此策略治愈了移植后受体发生的Epstein-Barr病毒（EBV）相关的淋巴增殖性疾病、巨细胞病毒感染和腺病毒感染，并发现运用DLI治疗这些肿瘤复发的并发症具有自身的特点：①这些感染来自供体，因此它是一种自体反应；②所需白细胞数量低，因而常不致引发GVHD[1，2]。

　　2 未经骨髓移植患者的DLI

　　DLI治疗allo-BMT后肿瘤复发与非肿瘤复发并发症的潜力是明显的。然而，此疗法能否用于未经强烈的催毁骨髓预处理方案的肿瘤患者，达到抗肿瘤效应的目的？Porter等[1]的研究证实：这种策略是可行而安全的，使用DLI前的免疫抑制是必需的，它便于供者免疫细胞维持植活和产生移植物抗肿瘤效应（GVT）。这种方法的优点在于：利用人类免疫系统抗肿瘤效应的同时舍弃了传统allo-BMT相关的潜在毒性。Anderson小组先用免疫抑制疗法，非催毁骨髓的药物剂量化疗，继用DLI治疗慢性淋巴细胞白血病和MDS等，均可获得完全缓解和长期植活。同样，Slavin小组用非催毁骨髓但较为强烈的药物剂量化疗，免疫抑制疗法和粒系集落刺激因子（G-CSF）动员的供者外周血细胞输注治疗具有allo-BMT适应症的白血病患者，结果在8个月的追踪观察期间，78%患者维持无病生存。

　　3 DLI的GVL效应机制

　　多年来，人们一直在寻找特异性GVL效应细胞，以便设计诱导GVL效应而限制GVHD的细胞治疗方案。在MHC一致的鼠移植模型中，去除供者CD3+T细胞后，GVL效应丧失[3]；在临床移植中，众多小组力求通过去除移植物中的T细胞，以达到预防GVH的目的，结果亦观察到了GVL效应的丧失[1]。而特异溶解白血病细胞的供者T细胞克隆的分离[4-6]，进一步证实了T细胞是GVL的重要效应细胞之一。一般认为T细胞按其表面标志分子的不同，分为CD4+和CD8+细胞群，那么何种T细胞亚群参与了GVL效应呢？选择性去除CD8+T细胞的异基因供者移植物移植时能减轻GVHD，而未见复发率的上升[1]，说明：CD4+T细胞群是GVL效应的重要参与者，CD8+T细胞参与GVH过程；但Faber等[7]观察到CD4+细胞不仅参与GVH过程，而且与MHC抗原分子结合参与免疫应答，提示同一CD4+细胞亚群亦诱导GVHD；Nieda等[6]用树突状细胞刺激的ABL-BCR特异性CD8+细胞克隆能有效地杀灭表达ABL-BCR融合抗原肽的CML细胞，说明CD8+细胞亦介导了GVL过程；这些证实CD4+、CD8+T细胞亚群均分别参与GVL、GVH过程。Tanaka等[8]根据T细胞分泌细胞因子和功能的不同，进一步将CD4+T细胞分为Th1、Th2、Th0亚群，CD8+T细胞分为Tc1、Tc2亚群。其中Th1亚群促进细胞免疫反应，可能是引发GVHD和GVL的主要细胞亚群；Th2则促进体液免疫，免疫耐受等，Th1、Th2亚群均来源于Th0亚群。Fowler等[9]观察到：在鼠移植模型中，CD8+Tc2亚群介导GVL，而减轻GVH；并在人体淋巴细胞中分离出了CD8+Tc2亚群；提示它可能是一类与GVL高度相关的细胞群。

　　供者白细胞中，除T细胞已被证明是GVL的效应细胞外，其它细胞成份也被观察到参与了GVL的过程。如allo-BMT后受者的自然杀伤细胞数目增加，活性增强；体外实验中供者NK细胞能溶解冰冻保存的宿主白血病细胞[1]。

　　总之，从上述移植模型和体外实验中，揭示供者CD4+Tc1、CD8+Tc2、NK细胞可能是GVL的重要效应细胞，其中CD8+Tc2已被证明具有GVL相关性。体外分离、克隆供者CD8+Tc2亚群用于GVL，可能是一种提高GVL、防止GVH发生的有效策略。

　　已被人们作为GVL的候选靶抗原归纳如表3。

表3 GVL的候选靶抗原

供受者不符的次要组织相容性抗原

A-3，HA-4，HA-5，HB-7，HB-8，HB-53，HCW-7，H-Y

细胞系列限制性抗原

造血系统特异蛋白　HA-1，HA-2

髓系特异性蛋白　蛋白酶3，CD33

淋巴系特异性蛋白　CD19，HB-1

白血病细胞特异抗原

染色体易位产物　BCR-ABL

基因突变产物　如ras癌基因突变

病毒转化产物　EBV蛋白

过分表达的正常蛋白　蛋白酶3，ras

白血病细胞特异抗原诱生的细胞毒T细胞最具杀伤特异性，而次要组织相容性抗原和造血细胞系列限制抗原诱发的细胞毒反应往往伴随正常组织的损害（GVHD）。

　　同种异体白细胞可识别宿主细胞表面主要组织相容性抗原、次要组织相容性抗原和肿瘤相关抗原。当供者白细胞输入受者体内时，NK细胞和单核巨噬细胞可非特异性直接杀伤受者体内的靶细胞。而强烈特异性T细胞的杀伤作用，一般需经历如下过程而产生：具备特异性抗原的白血病细胞在受者体内经抗原提呈细胞处理后提呈特异性抗原肽给CD4+Th１细胞，后者分泌细胞因子（如IL-2等）刺激CD8+Tc细胞活化、增殖，发挥特异GVL作用。同时CD8+Tc细胞亦能进一步活化其它反应细胞，如NK细胞、单核巨噬细胞。值得重视的是，这些免疫细胞之间的相互作用，尚分别依赖于MHCⅠ、Ⅱ类分子，B7/CD28通路及靶细胞上各种粘附分子和对应受体的存在与活性[10，14]。

　　淋巴细胞一般通过如下途径发挥GVL效应：①T细胞及NK细胞通过钙依赖的穿孔素途径直接溶解靶细胞；②T细胞通过缓慢的非钙依赖的Fas配体-Fas抗原（靶细胞）途径诱导靶细胞凋亡；③释放细胞因子杀伤靶细胞。然而白血病细胞往往通过下调MHCⅠ、Ⅱ类分子等的表达来逃逸GVL作用[10]。

　　4 增强GVL与控制GVHD效应

　　DLI治疗造血系统肿瘤的重要并发症是GVHD。近年来积累的研究已提出了如下分离GVL与GVHD的措施：①粒系集落刺激因子动员的供者外周血白细胞输注[15]；②低剂量但能发挥GVL的DLI；③去除引发GVHD的异基因反应细胞[9，16]；④自杀基因（单纯疱疹病毒胸苷激酶基因）导入供者淋巴细胞，若DLI后发生GVHD，则用丙氧鸟甘及时诱导杀灭供者淋巴细胞[17]；⑤阻断Fas/FasL通路[18]；⑥IL-12的应用（大剂量）[19]；⑦金属蛋白酶抑制剂（KB-7785）的应用[20]。然而上述方法分离和控制GVHD的同时，并未能增强GVL效应。

　　最近建立的体外克隆白血病特异淋巴细胞群用作DLI的策略，似可达到增强GVL，特异杀灭白血病细胞和防止GVHD的发生[4-6]。Molldrem等[5]根据蛋白酶3内的9肽序列——VLQELNVTV能高亲和性地结合HLA-A2.1位点，而且半衰期较长的特点，在体外用它来刺激HLA-A2.1阳性的供者外周血单个核细胞，克隆了针对蛋白酶3的淋巴细胞群，结果后者特异溶解了79%的新鲜CML细胞和54%的新鲜AML细胞，而对正常HLA-A2.1阳性的异基因髓细胞仅显示20%的溶解[5]。并显示89%～98%的HLA-A2.1阳性CML集落形成单位抑制率，但对正常HLA-A2.1阳性正常骨髓细胞和HLA-A2.1阴性的CML集落形成无抑制[4]。Nieda等[6]体外扩增加的bcr-abl特异的CD8+T细胞群，仅特异杀伤CML细胞。而且供者淋巴细胞与靶细胞间仅需单一MHC位点（结合靶抗原肽）相合[6]。这无疑为拓宽淋巴细胞供者来源，增加GVL和防止GVHD提供了一个全新的过继免疫治疗模式。

　　5 结语

　　DLI治疗造血系统肿瘤已被证明是有效并有广阔发展前途的方法。尤其应用于非骨髓移植患者时，充分利用于人体免疫细胞的GVT作用，舍弃了传统的allo-BMT的潜在毒性。但此疗法目前尚存在如下不足：①GVT作用尚不够强，缓解维持时间较短；②肿瘤细胞往往通过下调免疫应答相关分子表达发生免疫逃逸；③具有GVHD、受者造血不良等副作用；④HLA一致的淋巴细胞供者来源困难。最近发展的体外白血病细胞特异淋巴细胞扩增法，具有GVT强和特异性高，GVHD明显降低和淋巴细胞供者来源相对丰富的优点；提示它可能是本疗法的发展方向。未来的研究似应集中在：①识别和鉴定各型造血系统肿瘤的特异性抗原；②提高肿瘤细胞的免疫源性。后两个问题的突破，将使本疗法更趋完善。

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