【摘要】 
目的：从树突状细胞(DCs)的分子细胞水平初步探讨华蟾素提高机体免疫力的作用机制。方法：分离正常人外周血单核细胞，以GM-CSF+IL-4培养诱导DCs，采用自身配对设计分成对照组和华蟾素组（DCs培养48小时后加入华蟾素）。培养第7天镜下观察两组细胞形态的异同，用流式细胞仪检测DCs表面分子的表达水平，用CCK8检测DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，用ELISA法检测DCs培养液上清中IL-12的水平。结果：华蟾素组DCs与对照组比较细胞形态相对成熟，表面分子表达水平增高，刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和IL-12分泌能力增强。结论：华蟾素能增强正常人DCs的功能。

【关键词】  树突状细胞 华蟾素 外周血 流式细胞仪 酶联免疫吸附试验

      [Abstract]   Objective:To study the effect of Cinobufotalin on the morphous，phenotype and function of dendritic cells derived from peripheral blood of health adults, and to explain the mechanism of action of Cinobufotalin from the molecule and cell levels of DCs. Methods:Mononuclear cells of healthy adults were isolated from peripheral blood, and were cultured to induce DCs with the combination of GM-CSF and IL-4. Using self matched-pairs design two groups were divided in the experiment: controls and Cinobufotalin（Cinobufotalin was added to the culture media after the cells had been incubated for 48 hours）. On the 7th day, DCs of 2 groups were observed to compare the differences of the morphous, the expression of surface molecules on DCs were detected by flow cytometer; the DCs’ capacities of stimulating allogeneic lymphocyte proliferation was detected by cell count kit 8(CCK8), and the concentration of IL-12 in the supernatants of DCs’ cultures was detected by ELISA. Results:  compared with the controls, the DCs incubated with Cinobufotalin had more mature state, had higher expression of surface molecules, and higher capacities of stimulating allogeneic lymphocyte proliferation and secreting IL-12. Conclusion:Cinobufotalin can enhance the function of DCs of healthy adults.

    [Key words]   Dendritic cell; Cinobufotalin； Peripheral blood； Flow cytometer； Enzyme-linked immunosorbent assay

    华蟾素(cinobufotalin)是由中华大蟾蜍阴干的全皮为原料提取的水溶性制剂，应用于临床治疗乙肝及肝癌已有20多年的历史。临床应用表明其能显著提高机体的免疫功能[1，2]。但有关华蟾素作用机制的研究很少，本课题通过研究华蟾素对正常人外周血来源的树突状细胞(DCs)形态、表型和功能的影响，从DCs的分子细胞水平初步探讨华蟾素提高机体免疫功能的作用机制。

    1   材料与方法

    1.1   材料

    1.1.1   细胞因子和单克隆抗体   rhGM-CSF(北京宝赛生物技术有限公司)、rhIL-4(R&D Systems, Inc)、rhIL-2(南京军事医学科学院)、FITC-CD80鼠抗人单克隆抗体(BioLegend)、PE-CD86、FITC-CD40鼠抗人单克隆抗体(晶美生物工程有限公司)、PE-HLA-DR鼠抗人单克隆抗体、PE和FITC鼠IgG(CALTAG LABORATORIES)。

    1.1.2   主要试剂   RPMI-1640(Sigma公司)、小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)、淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)、IL-12 ELISA检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)、Cell count kit 8(CCK8，株式会社日本同仁化学研究所中国代表处)。

    1.2   方法

    1.2.1   对象   正常人16名，男女各半，为南通大学医学院老师和学生健康志愿者。

    1.2.2   外周血DC的体外诱导   取正常人外周血常规分离单个核细胞(PBMC)，悬浮(浓度为2×106/ml)后，加入24孔培养板(1ml/孔)。37℃，5%CO2培养箱中孵育2小时后吸弃上清，轻洗培养板去除非贴壁细胞，即获得贴壁的单核细胞。每孔加入DC培养液(1640+丁氨卡那霉素+10%小牛血清+IL-4+GM-SCF)1ml，IL-4(500U/ml)、rhGM-CSF(1000U/ml)，置37℃，5%CO2培养箱中培养。

    1.2.3   华蟾素最适药物浓度选择   取一正常人外周血常规分离单核细胞(Monocytes, Mo)，用96孔板培养诱导生成DCs。共分成6组，为5个浓度组和1个对照组。浓度组于培养48小时加入华蟾素，对照组不加华蟾素。用CCK8检测DCs增殖情况。选择最适华蟾素浓度于DCs培养的48小时加入。

    1.2.4   流式细胞仪检测DCs表型   采用直接荧光抗体标记各组DCs，用流式细胞仪检测DCs表面CD40、HLA-DR、CD80和CD86分子的表达。

    1.2.5   同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)   取一健康人外周血常规分离获得淋巴细胞，收获两组培养第7天的DCs，以DCs和淋巴细胞比例分别为1∶20、1∶40、1∶80混合培养，阴性孔不加DCs，置37℃，5%CO2培养箱中孵育96小时，用CCK8检测各组细胞的增值情况，用刺激指数(Stimulating index, SI)表示，SI＝实验孔OD490/阴性对照孔OD490。

    1.2.6   IL-12检测   留取2组培养第7天的DCs上清，用ELISA法检测IL-12的浓度。

    1.2.7   统计学方法   使用Stata7.0软件，进行自身配对t检验， P＜0.05为有统计学意义。

    2   结      果

    2.1   华蟾素最适药物浓度   收获加入不同浓度华蟾素培养第7天的DCs，用CCK8检测各组DCs的增殖情况。从曲线可以看出，加入不同浓度华蟾素的各组DCs均较未加华蟾素的DCs生长好，浓度为3×10-3mol/ml的一组DCs生长最好（见图1）。

    2.2   DCs培养过程中形态观察   华蟾素组与对照组相比，细胞数相对多，体积相对大，形态相对不规则(见图2)。

    2.3   华蟾素对DCs表型的影响   见表1。华蟾素组DCs表面分子表达水平比对照组高，其中CD40、CD80和CD86的差异有统计学意义(P<0.05)，HLA-DR的差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

    2.4   华蟾素对DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖能力的影响   见图3。DCs加入华蟾素后刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力较对照组强(P<0.05)。

    2.5   IL-12检测结果   用IL-12 ELISA试剂盒检测DCs培养第7天的上清。华蟾素组DCs和MLR上清中IL-12的含量（289.56±52.65pg/ml）较对照组（232.35±45.23pg/ml）高 (P<0.05)。

    3   讨      论

    DCs是目前已知的唯一能激活初始型T细胞的、功能最强的抗原提呈细胞(APC)，是机体免疫反应的始动者[3]。在免疫相关性疾病的发病中起重要作用，广泛参与各种自身免疫性疾病、免疫缺陷病、肿瘤、某些炎症反应和移植物排斥反应的病理过程。研究发现，DCs功能缺陷是一些慢性病毒感染和肿瘤的重要原因之一[4，5]。

    我们将华蟾素加入DCs培养液，培养第7天镜下观察发现，华蟾素组细胞比对照组相对多，细胞体积也相对大些，这说明华蟾素对DCs的生长发育有利；流式细胞仪检测表面分子表达水平显示，加入华蟾素后DCs表面分子的表达水平升高，同种异体混合淋巴细胞反应增强，这些结果提示了华蟾素能上调DCs协同刺激分子的表达，提高DCs的成熟度，增强DCs的作用。由此推断，华蟾素增强DCs功能可能是增强机体免疫力的重要方面。

    IL-12是DCs释放的迄今为止最有效的CTL和自然杀伤细胞活性刺激因子，能刺激它们分泌多种细胞因子，特别是Th1细胞分泌的γ-干扰素（IFN-γ），而IFN-γ反过来又可促进DCs功能的成熟和IL-12的分泌，它们之间形成了一个正反馈，最终对DCs诱导Th0向Th1分化起放大作用，在细胞免疫中发挥重要作用 [6，7]。Lohr等[8]用磁珠分选出CD34+造血干细胞，体外诱导生成DCs，将重组IL-12与之共孵育，结果与之共培养T细胞的增殖能力提高了2倍。我们的实验中加入华蟾素培养的DCs上清中IL-12的含量较对照组有所增高，说明华蟾素对DCs分泌IL-12有利，这也可能是华蟾素增强机体免疫力作用的又一方面。

    综上所述，华蟾素能增强正常人外周血DCs的免疫功能，这从DCs角度初步探讨了华蟾素增强机体免疫力的作用机制。但我们的研究对象是正常人，华蟾素是否也能增强慢性病毒感染和肿瘤患者DCs的功能还有待进一步研究。

【参考文献】
  [1] 樊万虎，李 芝. 华蟾素治疗慢性活动型乙型病毒性肝炎临床疗效观察[J]. 陕西医学杂志, 1998, 27(1): 38-41.

[2] 兰云南. 华蟾素治疗慢性乙型肝炎远期疗效观察[J]. 临床肝胆病杂志, 2002, 18(6): 374-378.

[3] Hart DNJ. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the primary immune response[J].Blood, 1997, 90(9): 3245-3251.

[4] Beckebaum S, Cicinnati VR, Dworacki G, et al. Reduction in the circulation pDC1/pDC2 ration and impaired function of ex vivo generated DC1 in chronic hepatitis B infection[J]. Clin Immunol,2002, 104: 138-142.

[5] Beckebaum S, Cicinnati VR, Zhang X, et al. Hepatitis B virus-induced defect of monocyte-derived dendritic cells leads to impaired T helper type 1 response in vitro mechanisms for viral immune escape[J]. Immunology, 2003, 109: 487-489.

[6] Rossol S, Marinos G, Carucci P, et al. Interleukin-12 induction of Th1 cytokines is important for viral clearance in chronic hepatitis B[J]. B J Clin Invest,1997,99:3025-3029.

[7] Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity[J]. Nat Rev Immunol，2003, 3(2): 133-136.

[8] Lohr HF, Pinger S, Bocher WO, et al. Reduced virus specific T helper cell induction by autologous dendritic cells in patients with chronic hepatitis B restoration by exogenous interleukin-12[J]. Clin Exp Immunol, 2002,130: 107-109.